E-カドヘリン抗体によるパラフィン包埋切片の免疫組織染色
| 使用抗体 | ： | Human E-Cadherin Monoclonal Anitbody（HECD-1、SHE78-7） | |
| 腑活用buffer | ： | 10 mMクエン酸buffer（pH6.0） | |
| TBS | ： | トリスアミノメタン | 1.24 g |
| トリスアミノメタン塩酸塩 | 6.27 g | ||
| NaCl | 8.77 g | ||
| 全量 | 1,000 ml | ||
※組織染色を行う場合、TBSへの塩化カルシウムの添加は特に必要ありません。
1．脱パラフィン（それぞれ100～150 ml容器を用いて行う）
| キシレン | 5分×3回 |
| 100％エタノール | 5分×2回 |
| 90％エタノール | 5分×1回 |
| 80％エタノール | 5分×1回 |
| 流水洗浄 | 2分 |
| 蒸留水 | 5分 |
2．抗原の腑活化
| （1） | 耐熱性のビーカーあるいはプラスチック製容器（電子レンジで使用可能なもの）を2個準備し、その中に切片を浸すのに充分量の腑活用buffer（10 mM クエン酸buffer, pH6.0）を加え、家庭用電子レンジのあたため（調理）モード（約500～900 W）で5分間照射する（preincubation）。 この時、密閉した容器を使用すると突沸し危険ですので、必ず蓋をずらして照射してください。 |
| （2） | 脱パラフィンした組織切片を片方の容器に浸し、同様に家庭用電子レンジのあたため（調理）モード（約500～900 W）で5分間照射する。 |
| （3） | 切片をもう一方のバッファーの入った容器に移し替えて、（2）と同様に電子レンジで照射する。 |
| （4） | ひとつの切片に対して6～8回（約30～40分）照射・移し替えの操作を繰り返し行ない、照射する毎にバッファーの入った容器を交換する（2つの容器を交互に使用する。） |
| （5） | 照射後、電子レンジから取りだし、そのまま室温で15～20分間放置冷却する。 |
| （6） | TBSに5分間浸す。 |
* 賦活操作中に切片が剥離しないように、スライドガラスは必ずシランコーティングしたものをご使用ください。
* TPX染色バットと染色用トレイ（テラオカ製）を用いると、20枚のスライドを同時に処理できて便利です。
3． 内因性Peroxidaseのブロッキング
| 3％過酸化水素溶液 | 5～15分 |
| TBS洗浄 | 5分 |
4．非特異的反応の阻止
ブロックエース（大日本製薬社製）原液または1％BSA/TBS
5～15分反応後TBSですすぐ
5～15分反応後TBSですすぐ
5． 一次抗体反応
抗体を25％ブロックエース/TBS、または１％BSA/TBSで下記の濃度に希釈して用いる。
HECD-1の場合
10 μg/ml 室温30～60分、または、2 μg/ml 4℃ 一晩
SHE78-7の場合
2 μg/ml 4℃ 一晩
反応後TBSですすぎ、TBSに浸漬 5分×3回
HECD-1の場合
10 μg/ml 室温30～60分、または、2 μg/ml 4℃ 一晩
SHE78-7の場合
2 μg/ml 4℃ 一晩
反応後TBSですすぎ、TBSに浸漬 5分×3回
6．二次抗体反応（各社から様々なキットが販売されている）
標識二次抗体を使用する方法、ENVISION（DAKO社製）を使用する方法など
反応後TBSですすぎ、TBSで浸漬 5分×3回
反応後TBSですすぎ、TBSで浸漬 5分×3回
7．発色（Peroxidaseの発色）
調製済みDAB基質溶液（DAKO、ニチレイ、シグマなど）を切片上に滴下する。
5～15分
顕微鏡を覗いて反応停止
蒸留水で洗い流して蒸留水に浸漬
5～15分
顕微鏡を覗いて反応停止
蒸留水で洗い流して蒸留水に浸漬
8．対比染色（核染色）
マイヤーのヘマトキシリン液に浸漬 1～5分
浸漬後、流水で洗浄脱色 10～15分
浸漬後、流水で洗浄脱色 10～15分
9．脱水・透徹
| 80％エタノール | 2～5分×1回 |
| 90％エタノール | 2～5分×1回 |
| 100％エタノール | 2～5分×2回 |
| キシレン | 2～5分×3回 |
10．封入
マウントメディウムで封入する。
