DNA Ligation Kit

プラスミドベクターへの外来DNAの挿入（Ver.2.1)

（1）プラスミドベクター〔0.03 pmol；pUC 18 DNA （2,686 bp）の場合約50 ng〕およびインサートDNA（0.03～0.3 pmol）を含むDNA溶液〔100 mM Tris-HCl（pH7.6）、 5 mM MgCl2が望ましい*〕5～10 μlを用意する。
（2）（1）のDNA溶液と等量のI液（5～10 μl）を添加し、よく混合する。
（3）16℃**で30分間***保温する。
（4）直ちに形質転換を行う場合には、100 μlのコンピテントセルに10 μl****の反応液を加える。

*	TE Buffer（10 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM EDTA）でもほぼ同様の効率が得られる。
**	反応温度を上げると（＞26℃）環状DNAが形成されにくくなる。
***	ライゲーションが起こりにくい場合は時間をのばしてもよいが、効率があまり変わらない場合にはDNAを精製し直した方がよい。なお、T-Vectorを用いてPCR産物のライゲーションを行う場合には、反応時間を1時間以内とする。長時間反応させるとバックグラウンドが高くなることがある。
****	Ligation kit溶液は反応後そのまま形質転換に用いることができるが、反応終了後の反応液9 μlに対して1 μlのIII液を加えてから形質転換に用いると、より多くのコロニー（形質転換体）を得ることができる。また、大量のDNA溶液をコンピテントセルに加える場合、およびエレクトロポレーションにより形質転換を行う場合は、エタノール沈殿によりDNAを回収してから行うこと。