Standard Protocol
（TransIT-LT1 Transfection Reagents）
6-well plate使用の場合（1ウェルあたりの分量を示す）
※ プレート種別によりウェル表面積が異なるため、トランスフェクション試薬とプラスミドDNAにより形成するComplexの1ウェルあたりの添加量が異なります。 また、ターゲットの細胞株により、トランスフェクション試薬：プラスミドDNAの最適な混合比率が異なります。下表を量比の初期条件として条件検討して下さい。
A. 細胞の用意
- トランスフェクション前日（トランスフェクションの約18～24時間程度前）に、目的細胞を2.5 mlの完全培地（血清含）に播種する。 播種する細胞数の目安は、接着系細胞の場合は、0.8～3.0×105 cells/ml、浮遊系細胞の場合は、2.5～5.0×105 cells/mlが一般的である。トランスフェクション時に細胞が＞80％コンフルエントとなることが望ましい。
- 一晩培養する。
B. Complexの形成（トランスフェクション直前に行う）
- TransIT-LT1試薬を室温に戻し、使用前に穏やかにボルテックスする。
- 滅菌済チューブに250 μlの無血清培地（Opti-MEM I低血清培地等)を用意する。
- 2.5 μgのプラスミドDNAを添加する。
- 完全に混ざるまでピペットで穏やかに混合する。
- 7.5 μlのTransIT-LT1試薬を（4）に添加する。
- 完全に混ざるまでピペットで穏やかに混合する。
- 室温で15～30分間インキュベートする。
C. トランスフェクション
TransIT-LT1試薬でのトランスフェクション操作は、血清を含む完全培地のままで行えるため、多くの場合、無血清培地への交換は不要である。
トランスフェクション前に新鮮な培地に交換することは必ずしも必要ではないが、もし必要があれば、前日から培養している細胞の培地を新鮮な完全培地（血清含）に交換する。
- ステップBで調製したTransIT-LT1/DNA complexを目的細胞に滴下し、プレートをゆっくりゆすってcomplexを均一に行き渡らせる。
- 24～72時間インキュベートする。
- 細胞を回収してレポーターアッセイ等で遺伝子導入効率を確認する。
| 6-well plate | 12-well plate | 24-well plate | 48-well plate | 96-well plate | 10-cm dish | T75 flask | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 培養面積／ウェル | 9.6 cm2 | 3.8 cm2 | 1.9 cm2 | 1.0 cm2 | 0.35 cm2 | 59 cm2 | 75 cm2 |
| 完全培地（血清含）量／ウェル | 2.5 ml | 1.0 ml | 0.5 ml | 263 μl | 92 μl | 15.5 ml | 19.7 ml |
| 無血清培地（Complex作成用） | 250 μl | 100 μl | 50 μl | 26 μl | 9 μl | 1.5 ml | 1.9 ml |
| TransIT-LT1 | 7.5 μl | 3 μl | 1.5 μl | 0.78 μl | 0.3 μl | 45 μl | 57 μl |
| プラスミドDNA（1 μg/μl） | 2.5 μl | 1 μl | 0.5 μl | 0.26 μl | 0.1 μl | 15 μl | 19 μl |
