Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   
   

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	最終濃度
   Premix Ex Taq (2×)	12.5 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.5 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.5 μl	0.2 μM*1
   プローブ	1 μl	*2
   template (＜100 ng)	2 μl	*3
   滅菌精製水	8.5 μl
   Total	25 μl

   *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 プローブ濃度は、使用するリアルタイムPCR装置の機種やプローブの蛍光標識物質により異なる。プローブ添付のデータシートを参考に添加量を検討する。Thermal Cycler Dice Real Time Systemの場合、通常、最終濃度0.1～0.5 μMの範囲で検討する。

   *3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。


2. 反応を開始する。
   PCRは、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。アニーリング／伸長時間は20～30秒に設定できますが、より安定した結果が得られる30秒で、まずお試しください。（下記の「PCR反応条件について」を参照）。
   
   
   

   　　Hold（初期変性）
   　　　　Cycle：1
   　　　　95℃　30秒
   
   　　2 Step PCR
   　　　　Cycle：40
   　　　　95℃　 5秒
   　　　　60℃　 30秒



3. 反応終了後、解析を行う。
   反応終了後、増幅曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   
   解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time SystemIII（IIおよびLite：終売）の取扱説明書を参照してください。

PCR反応条件について

サイクル数： 30～45サイクル