Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   
   
   ＜1反応あたり＞
   

   試薬	使用量	最終濃度
   Premix Ex Taq (2×)	10 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.4 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.4 μl	0.2 μM*1
   プローブ	0.8 μl	*2
   template (＜100 ng)	2 μl	*3
   滅菌精製水	6.4 μl
   Total	20 μl

   *1	最終プライマー濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
   *2	プローブ濃度は、使用するリアルタイムPCR装置の機種やプローブの蛍光標識物質により異なる。装置の取扱い説明書やプローブの添付データシートを参考に添加量を検討する。
   *3	template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。

   
   


2. 反応を開始する。
   PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
   *PCRは、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まず、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応を至適化してください (下記の「PCR反応条件について」を参照) 。
   
   

   Stage 2：PCR反応

   シャトルPCR標準プロトコール 　　Stage 1：初期変性 　　　　95℃　　30秒 20℃／秒 　　　　1サイクル 　　Stage 2：PCR反応 　　　　95℃　　 5秒　20℃／秒 　　　　60℃　　20秒　20℃／秒 　　　　40サイクル

   
   
3. 反応終了後、解析を行う。
   反応終了後、増幅曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   *解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。

PCR反応条件について

初期変性

シャトルPCR

サイクル数：30～45サイクル