Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズを用いる場合の操作方法
1. 下記に示す反応液を 氷上で調製する。
| 試薬 | 使用量 | 最終濃度 |
|---|---|---|
| 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer III | 12.5 μl | 1× |
| TaKaRa Ex Taq HS (5 U /μl) | 0.5 μl | |
| PrimeScript RT enzyme Mix II | 0.5 μl | |
| PCR Forward Primer (10 μM) | 0.5 μl | 0.2 μM*1 |
| PCR Reverse Primer (10 μM) | 0.5 μl | 0.2 μM*1 |
| total RNA | 2 μl | *2 |
| RNase Free dH2O | 8.5 μl | |
| Total | 25 μl |
*1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 total RNA 10 pg～100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。
2. 反応チューブまたはプレートを遠心機で軽く遠心後、Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズにセットし、反応を開始する。
反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。
Pattern 1：逆転写反応
Hold
42℃5分
95℃10秒
Pattern 2：PCR反応
Cycle：40
95℃5秒
60℃30秒
Pattern 3：Dissociation
※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5～)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃ 10秒で充分です。
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5～)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃ 10秒で充分です。
3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time Systemの取扱説明書をご参照ください。
One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
