One Step TB Green^® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を氷上で調製する。
   ＜1反応あたり＞
   

   試薬	使用量	使用量	最終濃度
   2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4	10 μl	25 μl	1×
   PrimeScript 1step Enzyme Mix 2	0.8 μl	2 μl
   PCR Forward Primer（10 μM）	0.8 μl	2 μl	0.4 μM*1
   PCR Reverse Primer（10 μM）	0.8 μl	2 μl	0.4 μM*1
   ROX Reference Dye or Dye II（50×）*3	0.4 μl	1 μl
   total RNA	2 μl	4 μl*2
   RNase Free dH2O	5.2 μl	14 μl
   Total	20 μl*4	50 μl*4

   
   

   *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 50 μl反応液あたりtotal RNA 20 pg～200 ngをtemplateとして使用することが望ましい。

   *3 ROX Reference Dye II (50×)は、ROX Reference Dye (50×)より濃度が低く設定されています。7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II (50×)の使用を推奨します。
   StepOnePlusおよび7300 Real-Time PCR Systemには、ROX Reference Dye (50×)を使用してください。

   *4 各装置の推奨容量に従って調整する。

2. 反応を開始する。
   PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。
   
   

   ＜Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞

   
   
   

   Stage 1,2 ：逆転写反応
   　　　　Reps：1
   　　　　42℃　5分
   　　　　95℃　10秒
   
   　　Stage 3：PCR反応
   　　　　Reps：40
   　　　　95℃　 5秒
   　　　　60℃　30～34秒^*
   
   Stage 4： Dissociation Protocol
   * StepOnePlusでは30秒に、7300では31秒に、7500では34秒に設定する。
   
   

   ＜Applied Biosystems7500 Fast Real-Time PCR System＞

   Holding Stage
   　　42℃　　5分
   　　95℃　　10秒
   Cycling Stage
   　　Number of Cycles：40
   　　95℃　　3秒
   　　60℃　　30秒
   Melt Curve Stage
   

   ※使用上の注意
   本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、 (5～)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
   PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃10秒で充分です。



3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、各リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について