One Step TB Green^® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を氷上で調製する。
   ＜1反応あたり＞
   

   試薬	使用量	最終濃度
   2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4	10 μl	1×
   PrimeScript 1step Enzyme Mix 2	0.8 μl
   PCR Forward Primer（10μM）	0.8 μl	0.4 μM*1
   PCR Reverse Primer（10μM）	0.8 μl	0.4 μM*1
   total RNA	2 μl	*2
   RNase Free dH2O	5.6 μl
   Total	20 μl

   *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 total RNA 10 pg～100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。

2. PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
   反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。
   
   
   

   Stage 1：逆転写反応
   　42℃ 5分 20℃／秒
   　95℃ 10秒 20℃／秒
   　1サイクル
   
   Stage 2：PCR反応
   　95℃ 5秒 20℃／秒
   　 60℃ 20秒 20℃／秒
   　40サイクル
   
   Stage 3：融解曲線分析
   　95℃ 0秒 20℃／秒
   　65℃ 15秒 20℃／秒
   　95℃ 0秒 0.1℃／秒

   
   Stage2：PCR反応

   ※使用上の注意
   本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、(5～)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
   PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃10秒で充分です。



3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、LightCyclerの取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について