PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase

PrimeSTAR® GXL DNA Polymeraseの高速PCRプロトコール

● 反応液組成

使用量
最終濃度
5×PrimeSTAR GXL Buffer10 μl1×
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μl各200 μM
primer 110～15 pmol0.2～0.3 μM*
primer 210～15 pmol0.2～0.3 μM*
Template下記参照
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase2μl2.5 U / 50μl
滅菌精製水up to 50μl

　* 10 kb以上の長鎖を増幅する場合、final conc. 0.2 μMで反応してください。

【推奨鋳型量】
（長鎖増幅の場合）
ヒトゲノムDNA5～500 ng（100～500 ng）
大腸菌ゲノムDNA100 pg～200 ng（10～200 ng）
プラスミドDNA10 pg～10 ng（1～10 ng）
cDNA25～750 ng（250～750 ng）

● PCR条件

【増幅鎖長が≦10 kbの場合】
98℃10 sec.
 
 30 cycles
55℃ or 60℃*115 sec.
68℃*210 sec./kb

*1 Tm値（下記の式※で計算）が55℃を超える場合はアニーリング温度を60℃に、Tm値が55℃以下の場合はアニーリング温度を55℃に設定してください。
　※ Tm値（℃）＝[（A、Tの数）×2]＋[（G、Cの数）×4]－5
*2 3 step PCRの場合も、伸長温度は68℃に設定してください。

【増幅鎖長が10 kb～20 kbの場合】
98℃10 sec.
 
 30 cycles
68℃20 sec./kb
　　または
98℃10 sec.
 
 30 cycles
60℃15 sec.
68℃10 sec./kb


◆PCR条件の選択
  • 10 kb以下の増幅は、3 step PCRで行ってください。2 step PCRでの反応はお勧めしません。
  • 10 kbを超える増幅においては、より短時間での反応を求める場合は3 step PCR、より特異性の高い反応を求める場合には2 step PCRをお勧めします。
  • GCリッチな鋳型については、標準プロトコールをお勧めします。

  PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase