CellAmp™ Direct RNA Prep Kit for One Step RT-PCR (Real Time)

CellAmp™ Direct RNA Prep Kit for One Step RT-PCR (Real Time) の操作
（製品コード 3731）

1. 試薬の準備

・下記に示すDNase溶液を氷上で調製する。
試薬 96ウェルプレート*1
1ウェル当たり
DNase I for Direct RNA Prep
DNase I Buffer for Direct RNA Prep		 1 μl
9 μl
Total 10 μl

*1 他のタイプのプレートを使用する場合は、下記の備考を参照してください。

2. 接着性の培養細胞からのライセート調製方法

  1. 96 ウェルプレート*の各ウェルに適切な数の細胞を播種する。
    　* 播種する細胞数については、Appendix-2を参照してください。
  2. 実験プロトコールに従って適当な細胞数、またはコンフルエントになるまで培養する。
  3. 培地を可能な限り吸引除去する。
  4. 各ウェルに125 μl*のCell Washing Bufferを加える。 　* 他のタイプのプレートをご使用の場合は、Appendix-2を参照してください。
  5. Cell Washing Bufferを可能な限り吸引除去する。
  6. 各ウェルに40 μl*のCell Processing Bufferを添加し、室温（15℃～28℃）で5分間インキュベートする。
    　* 他のタイプのプレートをご使用の場合は、下記の備考を参照してください。
  7. 各ウェルの細胞溶解液を数回ピッペッティングした後、PCRチューブまたは適当容量のマイクロ遠心チューブに移し、75℃で10分間インキュベートする。
  8. 氷上で冷した後、各サンプルに10 μl*の DNase 溶液を添加し、37℃で20分間インキュベートする。（ DNase 処理を行わない場合は、9. に進んでください。）
    　* 他のタイプのプレートをご使用の場合は、下記の備考を参照してください。
  9. プロトコールに従い、調製したライセートを鋳型として1ステップリアルタイム RT-PCRを行う。25 μlの反応系では、2 μl以下のライセートを使用してください。調製したライセートは氷上に保持し、20分以内にリアルタイムRT-PCRを行ってください。またライセートは－80℃で2週間程度保存可能です。

3. 浮遊性の培養細胞からのライセート調製方法

  1. 細胞数をカウントし、1×104 cells以下の細胞を、適当容量のマイクロ遠心チューブに移す。
  2. 300×gで5分間遠心操作を行う。
  3. 培地を可能な限り吸引除去する。
  4. 125 μl*のCell Washing Bufferを加える。
    　* 1×104 cellsを超える細胞数で使用する場合は、細胞数に比例して各試薬の使用量を増やしてください。
  5. 300×gで5分間遠心操作を行う。
  6. Cell Washing Bufferを可能な限り吸引除去する。
  7. 40 μl*のCell Processing Bufferを添加し、室温（15℃～28℃）で5分間インキュベートする。
    　* 1×104 cellsを超える細胞数で使用する場合は、細胞数に比例して各試薬の使用量を増やしてください。
  8. 75℃で10分間インキュベートする。
  9. 氷上で冷した後、各サンプルに10 μl*のDNase溶液を添加し、37℃で20分間インキュベートする。（DNase 処理を行わない場合は、10. に進んでください。）
    　* 1×104 cellsを超える細胞数で使用する場合は、細胞数に比例して各試薬の使用量を増やしてください。
  10. プロトコールに従い、調製したライセートを用いて1ステップリアルタイム RT-PCRを行う。25 μlの反応系では、2 μl以下のライセートを使用してください。調製したライセートは氷上に保持し、20分以内にリアルタイムRT-PCRを行ってください。またライセートは－80℃で2週間程度保存可能です。

備考：使用する培養プレートによる播種する接着細胞数の目安と、各試薬の1ウェルあたりの使用量

横にスクロールできます
  96ウェル 48ウェル 24ウェル 12ウェル 6ウェル
播種する細胞数目安（cells/well）*1×1042×1044×1048×1042×105
Cell Washing Buffer125 μl250 μl500 μl1 ml2.5 ml
Cell Processing Buffer40 μl80 μl160 μl320 μl800 μl
DNase I for Direct RNA Prep1 μl2 μl4 μl8 μl20 μl
DNase I Buffer for Direct RNA Prep 9 μl 18 μl 36 μl 72 μl 180 μl

* 一般的な接着細胞株、培養条件を用いた場合の目安の値です。使用する細胞株、培養 条件によっては、播種する細胞数を検討していただき、実験プロトコールを至適化 していただく必要があります。

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