TB Green^® Premix DimerEraser™ (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	使用量	最終濃度
   TB Green Premix DimerEraser（2×）	10 μl	25 μl	1×
   PCR Forward Primer（10 μM）	0.6 μl	1.5 μl	0.3 μM*1
   PCR Reverse Primer（10 μM）	0.6 μl	1.5 μl	0.3 μM*1
   ROX Reference Dye（50×）or Dye II（50×）*2	0.4 μl	1 μl	1×
   template（<100 ng）	2 μl	4 μl	*3
   滅菌精製水	6.4 μl	17 μl
   Total	20 μl*4	50 μl*4

   *1 最終primer濃度は0.3 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合にはROX Reference Dye II（50×）を、StepOnePlusにはROX Reference Dye（50×）を使用する。

   *3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10%以下になるようにする。

   *4 各装置の推奨容量に従って調製する。

2. 反応を開始する。
   PCRは、下記の3 step PCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
   反応性に問題がある場合には、下記の「PCR反応条件について」を参考に最適なPCR条件を検討してください。
   
   ＜Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞
   

   　　3 step PCR 標準プロトコール
   　　Stage 1：初期変性
   　　　　Reps：1
   　　　　95℃　30秒
   　　Stage 2：PCR反応
   　　　　Reps：40
   　　　　95℃　5秒
   　　　　55℃ 30秒
   　　　　72℃ 30秒 or 34秒^＊
   　　Melt Curve Stage
   
   　　＊ StepOnePlusでは30秒に、7500では34秒に設定する。

   ＜Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System＞

   　　　3 step PCR 標準プロトコール
   　　　Holding Stage
   　　　　　Number of Cycles：1
   　　　　　95℃　30秒
   　　　Cycling Stage
   　　　　　Number of Cycles：40
   　　　　　95℃　3秒
   　　　　　55℃　30秒
   　　　　　72℃　30秒
   　　　Melt Curve Stage
   

※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。

3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について

初期変性

PCR 条件と反応特異性

PCR条件と増幅効率