One Step TB Green^® PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

1. 下記に示す反応液を氷上で調製する。

＜1反応あたり＞

試薬	使用量	最終濃度
2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4	12.5 μl	1×
TaKaRa Ex Taq HS Mix	1.5 μl
PrimeScript PLUS RTase Mix	0.5μl
PCR Forward Primer（10 μM）	1.0 μl	0.4 μM *1
PCR Reverse Primer（10 μM）	1.0 μl	0.4 μM *1
total RNA	2.0 μl	*2
RNase Free dH2O	6.5 μl
Total	25 μl

2. 反応を開始する。

反応チューブまたはプレートを遠心機で軽く遠心後、Thermal Cycler Dice Real Time Systemにセットし、反応を開始する。
反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。

※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5～)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃ 10秒で充分です。

3. 反応終了後、解析を行う。

反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。

解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time System取扱説明書を参照してください。