LightCyclerを用いる場合の操作方法
One Step TB Green™ PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time) （製品コード RR096A/B）
- 下記に示すPCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞
試薬 使用量 最終濃度 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4 10 μl 1× TaKaRa Ex Taq HS Mix 1.2 μl PrimeScript PLUS RTase Mix 0.4 μl PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 0.4 μM*1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 0.4 μM*1 total RNA 2 μl *2 RNase Free dH2O 4.8 μl Total 20 μl
*1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 total RNA 10 pg～100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。
- 反応を開始する。
PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
* 反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化する。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行う。
Stage2：PCR反応
Stage 1：逆転写反応
42℃ 5分 20℃／秒
95℃ 10秒 20℃／秒
1サイクル
Stage 2：PCR反応
95℃ 5秒 20℃／秒
60℃ 20秒 20℃／秒
40サイクル
Stage 3：融解曲線分析
95℃ 0秒 20℃／秒
65℃ 15秒 20℃／秒
95℃ 0秒 0.1℃／秒※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、(5～)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃10秒で充分です。 - 反応終了後、解析を行う。
反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
One Step TB Green® PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
