反応液の調製
QuickPrimer (Real Time)シリーズ（製品コード MR101、MR103～107、MR111～113、MR203～205、MR208）
QuickPrimer (Real Time)シリーズ（製品コード MR101、MR103～107、MR111～113、MR203～205、MR208）
本製品を用いた各サンプルの反応は、必ず陽性コントロールDNA（10倍希釈液；用時調製）での反応および陰性コントロール反応と一緒に行ってください。各サンプルより得られたTm値が、同時に反応を行った陽性コントロールDNA（10倍希釈液）より得られたTm値±1.5℃の範囲（判定基準Tm値）に含まれるかどうかにより判定を行います。
精製DNA以外のサンプル（熱抽出サンプルなど）では、不純物の影響により、Tm値が判定基準Tm値に納まらない場合があります。そのような影響の有無を確認するためには、陽性コントロールDNA反応液にサンプルを加えて得られたTm値と、陽性コントロールDNAのみの反応で得られたTm値とを比較することをお勧めします。また、サンプルの精製度が低い場合やサンプル中のDNA量が多すぎる場合には、PCR反応が正常に行われず、偽陰性となる場合がありますのでご注意ください。
（1）反応液の調製（エリア 1 で実施）
下記に示す反応液を氷上で調製する。
サンプル以外のコンポーネントを必要本数＋αを調製し、アルミプレートにセットした反応チューブに17 μlずつ分注し軽く蓋をする。必要本数は、サンプル数＋2本（陽性コントロールDNA（10倍希釈液：用時調製）、陰性コントロールとして滅菌精製水を加えたもの）と設定する。
【Thermal Cycler Dice Real Time Systemの場合】
【Applied BiosystemsのリアルタイムPCR装置の場合】
| 試薬名 | 液量（1反応） | 最終濃度 |
| TB Green Premix Ex Taq（2×）*1 | 10 μl | 1× |
| Primer Mix（5×） | 4 μl | 1× |
| サンプルor 陽性コントロールDNA（10倍希釈液）*2, 3 or滅菌精製水 | （3 μl） | *4 |
| 滅菌精製水 | up to 20 μl |
【Applied BiosystemsのリアルタイムPCR装置の場合】
| 試薬名 | 液量（1反応） | 最終濃度 |
| TB Green Premix Ex Taq（2×）*1 | 10 μl | 1× |
| Primer Mix（5×） | 4 μl | 1× |
| サンプルor 陽性コントロールDNA（10倍希釈液）*2, 3 or滅菌精製水 | （3 μl） | *4 |
| ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II*5 | 0.4 μl | |
| 滅菌精製水 | up to 20 μl |
*1 反応に必要なバッファー、dNTP Mixture、酵素およびTB Greenを含みますので、
激しい撹拌は行わないようご注意ください。
*2 陽性コントロールDNAは、プライマーに対応したQuickPrimer (Real Time)シリーズ用Positive Control DNA
（QuickPrimer Control DNA 1、3～6、8～10、15）をご使用ください。陽性コントロールDNAをリアルタイムPCRコンポーネントに誤って混入すると、
正しい検出反応ができません。コンタミネーション防止のため、取り扱いには十分ご注意ください。
*3 陽性コントロールDNAは使用時に下記のように滅菌精製水で10倍希釈し、
このうち3 μlを反応系に添加してください。残った希釈液は保存せずに廃棄してください。
| QuickPrimer Control DNA | 3 μl |
| 滅菌精製水 | 27 μl |
| Total | 30 μl |
*4 サンプル等の鋳型は、この段階では加えないでください。サンプル（鋳型）は、1～3 μlの範囲で変更が可能です。
最終反応液量が20 μlになるように滅菌精製水量を加減してください。
*5 StepOne PlusにはROX Reference Dyeを、7500、7500 FastReal-Time PCR SystemにはROX Reference Dye IIを
ご利用ください。ROX Reference Dye/Dye IIは、TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）に含まれています。
Thermal Cycler Dice Real Time Systemを用いる場合は、ROX Reference Dyeの添加は不要です。
（2）滅菌精製水の添加
エリア1において（1）で反応液を分注したチューブの蓋をあけ、1本に陰性コントロール用としてサンプルの代わりに滅菌精製水を3 μl添加し、
しっかりと蓋をする。
エリア3に移動する。
（3）サンプルの添加（エリア3で実施）
（1）で反応液を分注した残りのチューブについて、サンプルまたは陽性コントロールDNA（10倍希釈液）を添加し、しっかりと蓋をする。
【注意】
蛍光ノイズの原因になりますので、チューブや蓋には素手で触れないようにしてください。
（4）反応チューブのセット
1）反応チューブを卓上遠心機で軽く遠心して、反応液をチューブの底に落とし、底部の気泡等を取り除く。
2）使用するチューブ数が少ない場合は、リアルタイム PCR装置の中央付近にセットし、端の列に空のチューブをセットする。
【注意】 反応液調製後、なるべく 30分以内に反応を開始してください。
