リアルタイムPCR
QuickPrimer (Real Time)シリーズ（製品コード MR101、MR103～107、MR111～113、MR203～205、MR208）
操作の手順は、それぞれのリアルタイムPCR装置で異なりますので、詳しい操作方法はそれぞれの機器の説明書をご確認ください。
【Thermal Cycler Dice Real Time System （食品環境検査用ソフト）の場合】
| （1） | ランファイルを新規作成し、“新規測定”画面において解析タイプ≪絶対定量≫を選択する。 |
| （2） | 反応条件設定画面でPCR条件を設定する。
初期変性（Hold） Cycle：1 95℃ 2分 3 step PCR Cycle：35 95℃ 20秒 55℃ 20秒 74℃ 20秒（検出） Dissociation |
| （3） | "反応開始"ボタンをクリックして反応を開始する。 |
| （4） | サンプル設定画面でサンプル情報の設定を行う。 |
| （5） | 結果解析 反応終了後、“結果／解析”ボタンをクリックする。 二画面の上部にサンプル検出のFAMフィルターでの増幅曲線（左図）を、下部に融解曲線（右図）を表示する。 あわせて、NC（陰性コントロール）、PC（陽性コントロールDNA） での増幅曲線および融解曲線を確認する。 |
| （6） | 上下いずれかの画面で“データ解析”＜テキストレポート＞を選択し、“表示項目”＜SDM法データ（2nd Derivative Maximum法による解析）＞のチェックをはずし、CP法データ（Crossing Point法による解析）の結果を表示する。 |
| （7） | “詳細項目”のTm#1、Tm#2にチェックを入れ、＜定量値 (CP)（検量線設定時にサンプル濃度を表示）＞のチェックを外す。必要に応じて、“詳細項目”より表示する項目を選択する。 |
注： “Speed”は、Thermal Cycler Dice Real Time System III（製品コード TP950）の場合はNormalに、Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900：終売）やLite（製品コード TP700：終売）ではFastを選択し、解析する際に正規化補正をOFFにしてください。
食品環境検査用ソフトウェアをご使用の場合、Speedの設定は各装置のデフォルト条件のまま、解析する際に正規化補正をOFFにしてください。
【Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systemの場合】
| （1） | Experiment Properties画面設定を行う。 ・ Quantification-Standard Curveを選択する。 ・ SYBR Green Reagentsを選択し、Include Melt Curveのチェックを確認する。 |
| （2） | 反応条件を設定し、チューブをセットし、反応をスタートする。
Stage 1：初期変性 Reps：1 95℃ 2分 Stage 2：PCR反応 Reps：35 95℃ 20秒 55℃ 20秒 74℃ 25秒（検出） Melting |
| （3） | 反応終了後、Analysis画面で、増幅曲線および融解曲線を確認し、Tm値を求める。 |
【StepOnePlus Real-Time PCR Systemの場合】
| （1） | Experiment Properties画面設定を行う。 ・Quantification-Standard Curveを選択する。 ・SYBR Green Reagentsを選択し、Include Melt Curveのチェックを確認する。 |
| （2） | 反応条件を設定し、チューブをセットし、反応をスタートする。
Stage 1：初期変性 Reps：1 95℃ 2分 Stage 2：PCR反応 Reps：35 95℃ 20秒 55℃ 20秒 74℃ 20秒（検出） Melting |
| （3） | 反応終了後、Analysis画面で、増幅曲線および融解曲線を確認し、Tm値を求める。 |
