MightyAmp™ for Real Time (TB Green^® Plus)

1. 各装置が推奨する反応液量に基づき、下記に示すPCR反応液を調製する。
   

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	使用量	最終濃度
   MightyAmp for Real Time（TB Green Plus）(2×)	10 μl	25 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.4 μl	1 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.4 μl	1 μl	0.2 μM*1
   ROX Reference Dye (50×) or Dye II (50×)*3	0.4 μl	1 μl	1×
   template	2 μl	4 μl	*2
   滅菌水	6.8 μl	18 μl
   Total	20 μl*4	50 μl*4

   *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10%以下になるようにする。

   *3 ROX Reference Dye II (50×)は、ROX Reference Dye (50×)より濃度が低く設定されている。 7500および7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析を行う場合には、ROX Reference Dye II (50×)の使用を推奨する。
   StepOnePlusには、ROX Reference Dye (50×)を使用する。

   *4 96ウェルプレート、シングルチューブおよび8連チューブでの反応は50 μl反応系で行う。384ウェルプレート、Fast System用の96ウェルプレート、8連チューブ（0.1 ml）での反応は20 μl反応系で行う。
2. 反応を開始する。
   PCR反応は、下記の標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。PCR条件を至適化する場合は、「PCR条件について」を参照してください。
   

   ＜Applied Biosystems 7000、7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞

   標準プロトコール
   
   　　Stage 1 ：初期変性
   　　　　Reps：1
   　　　　98℃　2分
   
   　　Stage 2 ：PCR反応

   Reps：40
   98℃　10秒
   60℃　15秒
   68℃　1分/kb
   　　　　（500 bp以下は30秒）

   
   　　Dissociation Stage
   
   

   ＜7500 Fast Real-Time PCR System＞

   
   標準プロトコール
   　　Stage 1 ：初期変性
   　　Reps：1
   　　98℃　2分
   Stage 2 ：PCR反応
   　　Reps：40
   　　98℃　10秒
   　　60℃　15秒
   　　68℃　1分/kb
   　　　　（500 bp以下は30秒）
   　　Melt Curve Stage

   ※使用上の注意
   本製品に使用しているMightyAmp DNA Polymeraseは強力なホットスタート抗体を使用しているので、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させてください。



3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、各装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について