標準プロトコール（製品コード R026A/B）
1．下記に示す反応液を調製する。
| 試薬 | 使用量 | 最終濃度 |
| 2×One Step High Fidelity Buffer | 25 μl | 1× |
| PrimeScript II RT Enzyme Mix | 1 μl | |
| PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR | 4 μl | |
| 上流 Primer（20 μM）（センス） | 1 μl | 0.4 μM |
| 下流 Primer（20 μM）（アンチセンス） | 1 μl | 0.4 μM |
| Template RNA*1 | *1 | |
| RNase Free dH2O | up to 50 μl |
| *1 | total RNAの場合は10～1000 ngの使用を推奨。 なお、Positive Control RNAの場合は1 μlを使用してください。 |
2．調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムでRT-PCRを行う。
| 一般的な反応条件 | 45℃*2 | 10 min. | ||
| 94℃ | 2 min. | |||
| ↓ | ||||
| 98℃ | 10 sec. | 30 cycles | ||
| 60 or 55℃*3 | 15 sec. | 68℃ | 10 sec./kb*4 | |
| *2 | 逆転写反応温度 PrimeScript II RTase（PrimeScript II RT Enzyme Mixに含まれる）は、プライミングの特異性が向上しているため、特異性が要求される下流プライマーからの逆転写反応をRNAの分解や酵素の失活の心配のない45℃で反応することができます。 6 kbを超える長鎖増幅の場合には、逆転写反応時間を15 min.にのばすことにより、cDNA合成量が向上する場合があります。 |
| *3 | アニーリング温度 プライマーのTm値（下記の式で計算）が55℃をこえる場合 →60℃に設定 プライマーのTm値（下記の式で計算）が55℃以下の場合 →55℃に設定 ※Tm値計算方法 Tm値（℃）＝［（A、Tの数）×2］＋［（G、Cの数）×4］－5 |
| *4 | 伸長時間は1 kbあたり10 sec.で設定してください。ただし、1 kb未満の場合は10 sec.にしてください。 |
