PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)

1. ゲノムDNA除去反応

下記に示すゲノムDNA除去反応液を氷上で調製する。
RNAサンプル以外のコンポーネントを必要本数＋α分調製し、マイクロチューブに分注後、RNAサンプルを添加するとよい。

＜1反応あたり＞

5×gDNA Eraser Buffer	2.0 μl
gDNA Eraser	1.0 μl
total RNA	*1
RNase Free dH2O
Total	10.0 μl

　↓
42℃、2 min（もしくは室温5 min^*2）

下記に示す逆転写反応液を氷上で調製する。
1. の反応液以外のコンポーネントを必要本数＋α分、Master mixとして調製し、1. の反応液に10 μlずつ添加する。^*3
直ちに反応液を軽く攪拌して均一にした後、逆転写反応を行う。

*1		20 μlの逆転写反応系で逆転写できるのは、おおよそ1 μgまでのtotal RNAです。
*2		室温での反応の場合、30分程度放置しても問題ありません。
*3		Master mixを調製せず、1. の反応液に個々の試薬を加えて逆転写反応液を調製する場合は、まずRNase Free dH2O と5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) を添加・混合してgDNA Eraserの活性を完全に抑制した後、RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加してください。さらに反応液を軽く攪拌して均一にした後、逆転写反応を開始します。
*4		RT Primer Mix を用いると、mRNA全長にわたり効率よくcDNA が合成されますが、別途ご用意されたOligo dT primerやGene Specific Primerを用いることも可能です。それぞれの場合の使用量は以下の通りです。 　　Oligo dT primer 50 pmol／20 μl反応系 　　Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl反応系
*5		逆転写反応は、必要に応じてスケールアップすることも可能です。
*6		Gene Specific Primerを用いる場合、逆転写反応を42℃、15分で行ってください。 PCR で非特異的な増幅が生じた場合には、逆転写温度を50℃に変更すると改善される場合があります。
*7		cDNA合成産物を長期保存する時は、－20℃以下で保存してください。

（注）逆転写反応液をリアルタイムPCRに持ち込む時は、PCR反応液容量の10％以下にしてください。