5×gDNA Eraser Buffer | 2.0 μl |
gDNA Eraser | 1.0 μl |
total RNA | *1 |
RNase Free dH2O | |
Total | 10.0 μl |
1. の反応液 | 10.0 μl | ||
5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) | 4.0 μl | Master mix 10 μl | |
PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0 μl | ||
RT Primer Mix*4 | 4.0 μl | ||
RNase Free dH2O | 1.0 μl | ||
Total | 20.0 μl | *5 |
*1 | 20 μlの逆転写反応系で逆転写できるのは、おおよそ2 μgまでのtotal RNAです。 | |
*2 | 室温での反応の場合、30分程度放置しても問題ありません。 | |
*3 | Master mixを調製せず、1. の反応液に個々の試薬を加えて逆転写反応液を調製する場合は、まずRNase Free dH2O と5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) を添加・混合してgDNA Eraserの活性を完全に抑制した後、RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加してください。さらに反応液を軽く攪拌して均一にした後、逆転写反応を開始します。 | |
*4 | RT Primer Mix を用いると、mRNA全長にわたり効率よくcDNA が合成されますが、別途ご用意されたOligo dT primerやGene Specific Primerを用いることも可能です。それぞれの場合の使用量は以下の通りです。 Oligo dT primer 50 pmol/20 μl反応系 Gene Specific Primer 5 pmol/20 μl反応系 | |
*5 | 逆転写反応は、必要に応じてスケールアップすることも可能です。 | |
*6 | Gene Specific Primerを用いる場合、逆転写反応を42℃、15分で行ってください。 PCR で非特異的な増幅が生じた場合には、逆転写温度を50℃に変更すると改善される場合があります。 | |
*7 | cDNA合成産物を長期保存する時は、-20℃以下で保存してください。 |
PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)