Thermal Cycler Dice® Real Time System IIを用いる場合の操作方法（自作のプライマーなどPRTSS 以外のプライマーを使用する場合）
TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR820A/B）
● 自作のプライマーなどPRTSS以外のプライマーを使用する場合
- 下記に示すPCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞試薬 使用量 最終濃度 TB Green Premix Ex Taq II（2×） 12.5 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 1 μl 0.4 μM *1 PCR Reverse Primer（10 μM） 1 μl 0.4 μM *1 template（＜100 ng）*2 2 μl 滅菌精製水 8.5 μl total 25 μl *3 *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10％以下とする。
*3 反応液量は25 μlを推奨。
-
反応を開始する。
PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。
シャトルPCR標準プロトコール
*4
Holding（初期設定）
Cycle：1
95℃、30秒2 Step PCR*4
Dissociation
Cycles：40
95℃、5秒
60℃、30～60秒
PCR条件を至適化する場合は、 「実験条件の選び方」をご確認ください。 ※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。 他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。 必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。
- 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)
- 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。