試薬 | 使用量 | 使用量 | 最終濃度 | |||
---|---|---|---|---|---|---|
TB Green Premix Ex Taq II(2×) | 10 μl | 25 μl | 1× | |||
PCR Forward Primer(10 μM) | 0.8 μl | 2 μl | 0.4 μM | *1 | ||
PCR Reverse Primer(10 μM) | 0.8 μl | 2 μl | 0.4 μM | *1 | ||
Rox Reference Dye(50×) or Dye II(50×)*2 | 0.4 μl | 1 μl | 1× | |||
template(<100 ng)*3 | 2μl | 4 μl | ||||
滅菌精製水 | 6μl | 16 μl | ||||
total | 20 μl | *4 | 50 μl | *4 |
*1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは 0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 ROX Reference Dye II(50×)は、ROX Reference Dye(50×)より濃度を低く設定している。
Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II(50×)を使用する。
StepOnePlusおよび7300 Real-Time PCR Systemには、ROX Reference Dye(50×)を使用する。
*3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。 20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして添加する場合は、 添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。
*4 各装置の推奨容量に従って調製する。
シャトルPCR標準プロトコール
Stage 1:初期変性
Reps:1
95℃、30秒
Stage 2:PCR反応
Reps:40
95℃、5秒
60℃、30秒~34秒*
Dissociation Stage
* StepOnePlusでは30秒に、7300では31秒に、7500では34秒に設定する。
シャトルPCR標準プロトコール
Holding Stage
Reps:1
95℃、30秒
Cycling Stage
Number of Cycles:40
95℃、3秒
60℃、30秒
Melt Curve Stage
※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。
他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。
必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。