Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus™ Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法
TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus）（製品コード RR820A/B）
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
- 下記に示すPCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞試薬 使用量 使用量 最終濃度 TB Green Premix Ex Taq II（2×） 10 μl 25 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM *1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM *1 Rox Reference Dye(50×) or Dye II(50×)*2 0.4 μl 1 μl 1× template（＜100 ng）*3 2μl 4 μl 滅菌精製水 6μl 16 μl total 20 μl *4 50 μl *4 *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは 0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 ROX Reference Dye II（50×）は、ROX Reference Dye（50×）より濃度を低く設定している。 Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II（50×）を使用する。
StepOnePlusおよび7300 Real-Time PCR Systemには、ROX Reference Dye（50×）を使用する。*3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。 20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、 添加量をPCR反応液容量の10％以下とする。
*4 各装置の推奨容量に従って調製する。
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反応を開始する。
PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。 （PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」 をご参照ください。）
＜Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞
シャトルPCR標準プロトコール
Stage 1：初期変性
Reps：1
95℃、30秒
Stage 2：PCR反応
Reps：40
95℃、5秒
60℃、30秒～34秒*
Dissociation Stage＊ StepOnePlusでは30秒に、7300では31秒に、7500では34秒に設定する。
＜Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System＞シャトルPCR標準プロトコール
Holding Stage
Reps：1
95℃、30秒
Cycling Stage
Number of Cycles：40
95℃、3秒
60℃、30秒
Melt Curve Stage※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。 他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。 必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。 -
反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
