核酸抽出

NucleoBond Xtra Midi（製品コード 740410.10、740410.50、740410.100）

1	培養液の調製 集菌	培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。 　培養液の液量（V）＝400/ OD600 (ml) *1 培養液を、4℃、4,500～6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。
2	菌の溶解	細胞ペレットを、Buffer RES（＋RNase A）*2 8 ml*3 に完全に溶解する。 Buffer LYS 8 ml*3 を細胞懸濁液に加え、穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。 室温で、5分間静置する。
3	カラムの平衡化	カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU 12 mlで平衡化する。 図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。 フィルター全体が湿っていることを確認する。
4	中和	Buffer NEU 8 ml*3 を、2の細胞懸濁液に加え、直ちに穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
5	ライセートの清澄化とローディング	4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。 液を自然落下させてカラムを空にする。
6	カラムの洗浄（1回目）	Buffer EQU 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。 図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
7	カラムフィルターの廃棄	カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
8	カラムの洗浄（2回目）	Wash Buffer WASH 8 mlで、カラムを洗浄する。
9	溶出	Elution Buffer ELU*4 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。 溶出液を15 ml遠心チューブ（各自で用意）に集める。
10	沈殿	イソプロパノール（室温）を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。 5,000×g以上で15分以上室温以下（好ましくは15,000×gで30分間、4℃）で遠心する。 上清を注意深く除去する。
11	DNAペレットの洗浄と乾燥	70%エタノール（室温）2 mlを沈殿に加え、5,000×g（好ましくは15,000×g）以上で5分間、室温で遠心する。 エタノールをチューブから完全に除去する。 5～10分間乾燥する。（乾燥しすぎるとDNAが溶解しにくくなるので注意する。）
12	DNAの溶解	適量のTE Bufferまたは滅菌蒸留水で溶解する。

*1	低コピープラスミドの場合は、培養液の液量（V）＝800/ OD600 (ml)
*2	Buffer RES（＋RNase A）の調製法 RNase A（凍結乾燥品）のチューブに1 mlのBuffer RESを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RESのボトルに移す。
*3	低コピープラスミドの場合は、16 ml
*4	BACのようなサイズの大きなプラスミドを溶出する場合は、Elution Buffer ELUを50℃に加温しておくと、回収率が上がる。