| 1 | 培養液の調製
集菌 | 培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。
培養液の液量（V）＝400/ OD600 (ml) *1
培養液を、4℃、4,500～6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。 |
| 2 | 菌の溶解 | 細胞ペレットを、Buffer RES（＋RNase A）*2 8 ml*3 に完全に溶解する。
Buffer LYS 8 ml*3 を細胞懸濁液に加え、穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
室温で、5分間静置する。 |
| 3 | カラムの平衡化 |  | カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU 12 mlで平衡化する。
図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。
フィルター全体が湿っていることを確認する。 |
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| 4 | 中和 | Buffer NEU 8 ml*3 を、2の細胞懸濁液に加え、直ちに穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。 |
| 5 | ライセートの清澄化とローディング | 4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。
液を自然落下させてカラムを空にする。 |
| 6 | カラムの洗浄（1回目） | |
Buffer EQU 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。
図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。 |
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| 7 | カラムフィルターの廃棄 |  | カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。 |
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| 8 | カラムの洗浄（2回目） |  | Wash Buffer WASH 8 mlで、カラムを洗浄する。 |
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| 9 | 溶出 | Elution Buffer ELU*4 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。
溶出液を15 ml遠心チューブ（各自で用意）に集める。 |
| 10 | 沈殿 |  | イソプロパノール（室温）を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。 |
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| NucleoBond Finalizerを用いた精製（所要時間：約5分） |
| 11 | 沈殿のローディング |  | 30 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、出口にNucleoBond Finalizerを取り付ける。
沈殿混液をシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してFinalizerに通す。
流出液は廃棄する。 |
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| 12 | 沈殿の洗浄 | | 30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。
Finalizerをシリンジの出口に再びとりつける。
70%エタノール2 mlをシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してエタノールを押しこみ、Finalizerに通す。
流出したエタノールは廃棄する。 |
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| 13 | 膜フィルターの乾燥 | |
30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。
Finalizerを再びシリンジの出口に取り付ける。
残ったエタノールを飛ばすため、プランジャーを挿入して空気を押しこみ、Finalizerに通す。
エタノールが全く出てこなくなるまで、このステップを3回以上繰り返す。
（キムタオル等の上で、Finalizerの先からエタノールが出てこないことを確認する。） |
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| 14 | DNAの溶出 |  | 30 mlシリンジからFinalizerを取り外す。
1 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、Finalizerをシリンジの出口に取り付ける。
適量のBuffer TRIS（またはTE Buffer）200～800 μlをシリンジの中に加える。
Finalizerの出口を新しい回収チューブにセットし、プランジャーを挿入してプラスミドを溶出する。
1 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。
Finalizerをシリンジの出口に再び取り付ける。
最初の溶出液をシリンジに戻し、同じ回収チューブの中に再び溶出する。 |
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