NucleoSpin® RNA XS

培養細胞・組織からのRNA抽出プロトコール

NucleoSpin® RNA XS（製品コード 740902.10/740902.50/740902.250）

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1．試薬の準備

TCEP＊1，Carrier RNA溶液＊2，rDNase溶液＊4，Buffer RA3＊5が添付のprotocolに従って調製、希釈されていることを確認する。
2. サンプルの準備
組織：5 mgの組織を用意する。液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、またはホモジナイザー処理などで細分化処理を行う。
細胞：1×105個の培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合は、ディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。
3. サンプルの溶解
Buffer RA1 200 μl（組織の場合）または100 μl（細胞の場合）にTCEP＊1 4 μl（組織の場合）または2 μl（細胞の場合）を添加した溶液を、組織または細胞に添加し、vortexを行い（5秒間×2回）、均一にホモジナイズする。
4. キャリアRNAの添加

Carrier RNA希釈溶液＊2 5 μlを添加する。vortexを行い（5秒間×2回）、スピンダウンする。
5. ライセートのろ過
    （オプション）
NucleoSpin Filter（紫のリング）をCollection Tube（2 ml）にセットする。
4のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、30秒間遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除く。＊3
※サンプルが少量の細胞の場合は、この操作は除いてもよい。
6. エタノールの添加

ろ液に70％エタノール200 μl（組織の場合）または100 μl（細胞の場合）を添加し、よく混合する。
7. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA XS Column（水色のリング）を用意する。
6の溶液をカラムに添加し、11,000×g、30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。
8. メンブレンの脱塩
MDB 100 μlをカラムに添加し、11,000×g、30秒間遠心する。
9. DNase処理
rDNase溶液*4 3 μlとReaction Buffer for rDNase 27 μlを混合し、DNase reaction mixtureを調製する。
DNase reaction mixture 25 μlをシリカメンブレンの中央へ直接添加し、室温（18～25℃）で15分間インキュベートする。
10. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer RA2 100 μlをカラムに添加し、室温で2分間インキュベートした後、11,000×gで30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。
2回目の洗浄
Buffer RA3*5 400 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、再び同じCollection Tubeにセットする。
3回目の洗浄
Buffer RA3*5 200 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（1.5 ml）にセットする。
11. RNAの溶出
RNase-free H2O 10 μlをカラムに加え、11,000×gで30秒間遠心する。
溶出したRNA溶液は、－20℃または－70℃で保存する。

*1 TCEP
製品コード 740902.10（10回用）の場合：TCEP 1 vial（14 mg）にRNase free H20 100 μlを加え、室温で数分インキュベートし、完全に溶解する。調製したTCEP溶液は、－20℃で保存する。

*2 Carrier RNA溶液
ストック溶液：Carrier RNA 1 vial（300 μg）にBuffer RA1 750 μlを添加し、400 ng/μlの溶液を調製する。 －20℃で保存する。
希釈溶液：ストック溶液を、Buffer RA1で100倍希釈する。（例：Carrier RNAストック溶液 1 μl ＋ Buffer RA1 99 μl） 希釈溶液は使用直前に調製する。保存不可。

*3 ろ液に沈殿が見られた場合は、上清を別のチューブに移してから70％エタノールを添加する。

*4 rDNase溶液
製品コード 740902.10（10回用）の場合：rDNase 1 vial にRNase free H20 55 μlを加え、室温で1分インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、－20℃に保存する。（6ヵ月間安定）

*5 Buffer RA3
製品コード 740902.10（10回用）の場合：Wash Buffer RA3(Concentrate) 6 mlに96～100%エタノール  24 mlを添加する。

注意
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書を確認すること。

*1、*2、*4、*5は製品コード740902.10（10回用）の場合の調製法である。
製品コード、740902.50（50回用），740902.250（250回用）の場合の調製法は英文説明書を参照すること。

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