EpiScope^® Nucleosome Preparation Kit

1. 培養プレートから細胞を回収し、約1×10⁶ cells/mlとなるように適当量のPBSを加えて懸濁し、1.5 mlマイクロチューブに1 mlずつ分注する。
   ※ 1反応あたり約0.5～2×10⁶ cellsの処理を推奨。
2. 3,000 rpm、4℃、3分間遠心し、細胞を回収する。
3. 上清を除去し、Protease Inhibitor Cocktail 10 μlを加える。
4. Cytoplasmic Lysis Buffer 1 mlを加え、ピペッティングにより十分に懸濁する。
5. 氷上で10分間静置する。
6. 5,200 rpm、4℃、10分間遠心する。遠心の間に、10×Micrococcal Nuclease Bufferを滅菌精製水で希釈して、1×Micrococcal Nuclease Buffer 100 μlを調製する。
7. 遠心上清を除去し、遠心沈渣（細胞核を含む）に1×Micrococcal Nuclease Buffer 50 μlを添加後、ピペッティングにより十分懸濁し、細胞核懸濁液とする。
   ※ Micrococcal Nuclease Buffer 添加後、ピペッティングを十分行い、遠心沈渣を出来る限り懸濁してください。十分懸濁を行った後も沈渣の塊が多少残る場合がありますが、これらを完全に懸濁する必要はありません。

1. 反応数＋α分のマスターミックスを室温で調製する。

   試薬	1反応あたり使用量
   Micrococcal Nuclease (20 U/μl)	0.2 μl
   Micrococcal Nuclease Buffer (10×)	5.0 μl
   RNaseA	2.0 μl
   Protease Inhibitor Cocktail (100×)	1.0 μl
   滅菌精製水	41.8 μl
   合計	50 μl

   （注）氷上で調製すると塩が析出するため、必ず室温で調製してください。
   ・Micrococcal Nucleaseは反応開始直前に添加してください。
2. 0.2 mlマイクロチューブにマスターミックスを50 μl分注し、A-7の細胞核懸濁液 50 μlを加えて混合する。
3. 37℃で30分間インキュベートする（サーマルサイクラー使用）。
4. マイクロチューブへ0.5 M EDTAを2 μl加え、反応を停止する。
5. Proteinase Kを4 μl加え、37℃で30分間インキュベートする（サーマルサイクラー使用）。
   引き続き、「C. DNA抽出」の操作を行う。

1．B-5で調製したProteinase K処理サンプルから、NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを用いてDNAを抽出する。

• Proteinase K処理サンプル106 μlにBinding Buffer NTIを212 μlを加える。
• NucleoSpin Gel and PCR Clean-up ColumnをCollection Tube（2 ml）にセットする。
  （1）の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
  ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
• Wash Buffer NT3（エタノール含）700 μlをカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
  ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
• カラムを、11,000×g、2分間遠心する。
• カラムをマクロチューブ（1.5 ml：各自で用意）にセットする。
  Elution Buffer NE 50 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×g、1分間遠心する。

2．得られたDNA溶液の一部（約5 μl）を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、DNAサイズを確認する。