CycleavePCR™ Salmonella Detection Kit Ver.2.0

Runが終了すると、自動的に最適なパラメータが設定され解析が行われます。解析結果を確認し、Auto設定で正しく解析されていない場合には、マニュアルでパラメータを設定し再解析を行います。Crossing Point法ではPrimary Curveのベースラインと閾値（Threshold）を、を設定します。
Crossing Point法： 増幅曲線（Primary Curve）と閾値の交点をCt値とする方法。

Analysis DataからAmplification Plotを選択します。 FluorescenceからPrimary Curveを選択するとAnalysis Settingが表示されます。 Analysis Settingで解析対象のFilterを選択します。 Baselineタブをクリックしてベースラインの設定項目を表示させます。

すべてのウェルにつき同じサイクル範囲を設定する場合 Manualを選択し適切なStartとEndの値を入力します。Applyボタンをクリックするとグラフ表示が更新されます。 個々のウェルごとに異なるサイクル範囲を設定する場合 Edit IndividuallyボタンをクリックしてBaseline Setting画面を表示させます。 設定を行うウェルのA/M（Auto/Manual）カラムのドロップダウンリストからManualを選択します。編集中のウェルでは、最左列に「※」が表示されます。 設定を行うウェルのStartまたはEndのセルをダブルクリックして数値を入力します。 Applyボタンをクリックします。 設定が終了したらOKボタンをクリックします。

（補足）	ベースラインは、増幅が検出されない初期のサイクル範囲に設定します。ウェルごとに増幅曲線の立ち上がり位置が大きく異なる場合は、同一のベースライン範囲を適用するよりも、ウェルごとに最適な範囲を設定した方が正確な結果が得られます。特に、立ち上がり部分も含んでベースライン範囲を設定すると正しい補正が行われませんのでご注意ください。なお、Autoの場合は、個々のウェルについて最適なベースライン範囲を設定しています。

Baseline補正が正しく行われた例

Baseline補正が不十分な例

Baseline補正が過度な例

Primary Curveに対して縦横2種類のThresholdを設定します。横のThresholdは、Primary Curveとの交点をCt値として算出するのに用いられます。縦のThresholdは、サイクル初期に蛍光値の変動がある場合に、その領域を解析から除外するために設定します。なお、Targetが複数存在する場合には、ThresholdをTargetごとに最適な位置あるいはすべてのTargetに共通の位置に設定することができます。その選択は、以下のようにTo each targetのチェックボックスで行います。

Targetごとに個別に設定

すべてのTargetに共通の設定

1. Analysis DataからAmplification Plotを選択します。
2. FluorescenceからPrimary Curveを選択します。
3. グラフのY軸をLog表示に変えます。

グラフ上で右クリックしメニューから［Y axis］→［Scale］→［Log］を選択します。あるいは、グラフをダブルクリックしChart Properties画面を表示させY axisのScaleでLogを選択します。


4. Analysis Settingで解析対象のFilterを選択します。
5. Thresholdタブをクリックして、閾値の設定項目を表示させます。
6. Manualを選択すると、右側の入力フィールドがアクティブになります。
7. 入力フィールドに数値を入力するか、グラフ上のThreshold lineをドラッグして移動させます。横のThresholdは、指数関数的増幅域（Y軸をLog表示にしたときに増幅曲線が直線になる範囲内）に設定します。Applyボタンをクリックするとグラフ表示が更新されます。

Thresholdが適切な例

Thresholdが低すぎる例

Thresholdが高すぎる例

Thermal Cycler Dice Real Time System 取扱説明書 《ソフトウェア・操作編》より抜粋