核酸抽出・精製

NucleoSpin^® Gel and PCR Clean-up

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Q1　アガロースの溶解が十分にできない。

A1　アガロースの量が多すぎる。

温度と時間が適切でない。

アガロースゲルが完全に溶解されるまで、50℃で温め、2分ごとにボルテックスしてください（所要時間5～10分間）。非常に大きなゲル切片の場合は、Buffer NTIを加える前にゲルを細かくしておいてください。

Q2　DNAの収量が低い

A2　 Wash Buffer NT3の調製が正しくない。

ゲル切片が十分に溶解していない。

Buffer NTI添加後の溶液のpHが高すぎる

DNAがカラムへ結合する際の至適pHは5～6であり、この場合pH Indicatorにより溶液の色は黄色となります。溶液の色が緑色または青色の場合はpHが高いので、調整する必要があります。Buffer NTIの追加添加や、4M 酢酸ナトリウム（pH 5.0）もしくは少量の塩酸を添加して、溶液の色を黄色にしてください。

シリカメンブレンの乾燥が不十分

Buffer NT3（エタノールを含む）を完全に除去するために、スピンカラムの洗浄後、11,000×gで5分間遠心するか、あるいは溶出前にカラムを70℃で2～5分間インキュベートしてください。Collection Tubeを遠心機から取り出し、ろ液を捨てるステップでは、スピンカラム先端をろ液に接触させないように注意してください。

カラムからの溶出が不十分

DNA断片が大きい（>1000 bp）、DNA量が多い（>5 μg）、もしくはアガロースゲルからの精製の場合、溶出時の回収率が低下する場合があります。DNAの回収率を高めるためには、以下のオプションをお試しください（英文取扱説明書2.6 DNA recovery depends on fragment size and elution volume参照）。
〇あらかじめ溶出バッファーを70℃で予温し、カラムに添加後、5分間70℃でインキュベートした後遠心する。
〇溶出液をカラムに添加後、30～50×gで1分間遠心したのち、11,000×gで1分間遠心する。
〇溶出後、その溶出液をカラムに添加し、再度溶出ステップを行う。

PCR Bufferの影響

MightyAmp DNA Polymerase Ver.3（製品コード R076A/B）などのMightyAmpシリーズやTaKaRa Ex Premier DNA Polymerase（製品コード RR370S/A/B、RR371S/A/B）を用いて増幅したPCR産物の場合は、PCR反応液を滅菌水で、1.5～2倍に希釈し、希釈した溶液の2倍量のBuffer NTIを加えてください。

Q3　回収したDNAをアガロースで電気泳動すると、本来のサイズ以外のバンドがでる。

A3　精製過程においてDNAが変性している

溶出バッファーとして滅菌水を使用したり、アガロースゲル電気泳動でイオン含量の低いアガロースを用いると、変性（一本鎖）DNAが形成される場合があります。その場合、DNAの再アニーリングを行ってください。
目的の酵素反応を行う際に、酵素以外のコンポーネントを加え、95℃で2分間インキュベートした後、反応液を室温までゆっくり冷ましてください。（このステップでDNAが再アニーリングします。）そのあと、酵素を加えて目的の実験を行います。

Q4　抽出したDNAを用いてシーケンス、制限酵素切断、ライゲーション反応がうまくいかない。

A4　エタノールや、Buffer NT3（エタノールを含む）の持ち込みがある。

Buffer NT3（エタノールを含む）を完全に除去するために、溶出バッファーを添加する前に11,000×gで5分間遠心するか、あるいはカラムを70℃で2～5分間インキュベートしてください。Collection Tubeを遠心機から取り出し、ろ液を捨てるステップでは、スピンカラム先端をろ液に接触させないように注意してください。

試薬由来のカオトロピック塩の持ち込みがある。

Buffer NT以外のバッファー、例えばTE Bufferを用いてDNAを溶出した。

シーケンス反応に用いたDNA量が不十分だった。

UVライトでDNAが損傷した。

Q5　NanoDrop分光光度計またはAgilent社のバイオアナライザーでDNAの定量ができない。

A5　微量のシリカ粒子の持ち込みがある。

NanoDrop分光光度計などは、サンプル中の粒子の影響を強く受けます。シリカ粒子を沈殿させるために、溶出したDNA溶液を11,000×gで2分間以上遠心し、その上清を使用してください。

Q6　OD₂₆₀/OD₂₃₀の比が低い。

A6　試薬由来のカオトロピック塩の持ち込みがある。