1. サンプルの準備 | | 100 mgの植物組織を用意する。液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、などの細分化処理を行う。
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2. サンプルの溶解 | | Buffer RA1 350 μl(2-MEまたは1 M(~2 M)DTT 3.5 μlを添加)を植物組織に添加し、均一にホモジナイズする。
(サンプルにBuffer RA1を加えてうまく溶解しない場合は、代わりにBuffer RAPを用いて溶解する。)
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3. ライセートのろ過 | | NucleoSpin Filter(紫のリング)をCollection Tube(2 ml)にセットする。
2のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、1分間で遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除き、ろ液を別の1.5 mlチューブにうつす。*1
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4. エタノールの添加 |
| ろ液に70%エタノール 350 μlを添加し、よく混合する。 (スピンダウンは避ける。スピンダウンした場合は沈殿物も全て5のカラムに添加する。) |
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5. カラムへの吸着 | | NucleoSpin RNA Plant Column(水色のリング)を用意する。
4の溶液をカラムに添加し、11,000×g、30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube(2 ml)にセットする。 | |
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6. メンブレンの脱塩 | | MDB 350 μlをカラムに添加し、11,000×g、1分間で遠心する。 | |
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7. DNase処理 | | rDNase溶液*2 10 μlとReaction Buffer for rDNase 90 μlを混合し、DNase reaction mixtureを調製する。
DNase reaction mixture 95 μlをシリカメンブレンの中央へ直接添加し、室温(18~25℃)で15分間インキュベートする。 |
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8. メンブレンの洗浄 | | 1回目の洗浄
Buffer RAW2 200 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube(2 ml)にセットする。 | |
2回目の洗浄
Buffer RA3*3 700 μl*4 をカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、再び同じCollection Tubeにセットする。 | |
3回目の洗浄
Buffer RA3*3 250 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube(1.5 ml)にセットする。 | |
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9. RNAの溶出 | | RNase-free H2O 60 μlをカラムに加え、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したRNA溶液は、-20℃または-70℃で保存する。 | |
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