RspRS II（Mse I）

制限酵素RspRS IIはMse Iのアイソシゾマーであるが、至適反応温度が60℃と高く、Mse Iに比べて非常に安定な酵素である。
RspRS IIおよびMse Iの認識配列はTTAAであり、ゲノムDNA中で比較的GC-richなCpG Island周辺は切断しない。そのため、MCIp（Methyl-CpG Immunoprecipitation）などでメチル化CpG濃縮を行う際に、ゲノムDNAを断片化するために用いられる。
本実験では、Methyl-CpG binding domain protein2（MBD2）と磁気ビーズを利用してメチル化CpGを濃縮するEpiXplore Methylated DNA Enrichment Kitを用いて、RspRS IIにより断片化されたゲノムDNAが、Mse Iにより断片化されたゲノムDNAと同様に濃縮されることを確認した。

【実験の概要】

HeLa cell genomic DNA　　4 μg

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RspRS II、またはMse Iによる断片化

↓

NuceloSpin Gel and PCR Clean-upを用いて反応液をクリーンアップ

↓

溶出液 60 μｌ　→　Fraction 0

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約1.2 μg分をEpiXplore Methylated DNA Enrichment KitでのCpGメチル化DNA濃縮に使用 Non-methylated and hypomethylated DNA　→　Fraction I Methylated DNA　→　Fraction III

RspRS IIおよびMse Iを用いて、HeLa細胞のゲノムDNAを断片化した。それぞれの推奨バッファーを用いた200 μl反応系で、ゲノムDNA 4 μgに対して各制限酵素100 Uを使用し、RspRS IIは60℃で、Mse Iは37℃で3時間反応を行った。

M1 λ-Hind III digest 1 HeLa cell genomic DNA 2 RspRS II digest 3 Mse I digesrt 1％ Agarose L03使用 Fraction 0の2 μl分を泳動

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（製品コード 740609.10）を用いて、上記反応液をクリーンアップし、
60 μlで溶出した。⇒［Fraction 0］。それぞれNanodropでOD₂₆₀を測定し、DNA濃度を求めた。

DNA濃度

Fraction 0 of RspRS II digest	62.9 ng/μｌ
Fraction 0 of Mse I digest	65.7 ng/μl

M1 λ-Hind III digest 1 HeLa cell genomic DNA 2 Fraction 0 of RspRS II digest 3 Fraction 0 of Mse I digesrt M2 DL2,000 DNA Marker 1％ Agarose L03使用 Fraction 0の2 μl分を泳動

各Fraction 0の約1.2 μg分を、EpiXplore Methylated DNA Enrixchment Kit（製品コード 631963）を用いたCpGメチル化DNA濃縮に使用した。プロトコールに従って、MBD2への結合・洗浄・溶出を行い、各画分をエタノール沈殿で回収して30 μlに溶解した。

・NanodropによるDNA濃度測定～回収率の比較
＊ Control（EpiXplore Methylated DNA Enrixchment Kit のコンポーネント）：Methylated DNA 200 ng＋Non-methylated DNA 200 ng

RspRS II digestおよびMse I digestから得たFraction 0、I、IIIをそれぞれ鋳型として、非メチル化状態が予想されるexon領域、あるいはメチル化が予想されるCpG Islandを含むプロモーター領域やその周辺をターゲットとしてPCR増幅を行った（Negative Control-1、2、およびPositive Control-1～3）。増幅にはTks Gflex DNA Polymerase（製品コード R060A）を使用した。


＊1 MBD2に結合せずに残存したMethylated DNAによる増幅と考えられる。