次世代シーケンス（NGS）解析への応用例（207 plex PCR）
Multiplex PCR Assay Kit Ver.2（製品コード RR062A/B）
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2（Thermo Fisher Scientific社）と本製品を用いて、ヒトゲノムDNAを鋳型に207ターゲットのマルチプレックスPCRを行い、ライブラリーを作成してNGS解析を実施した。
また、そのうち任意に選択した16ターゲットについて、マルチプレックスPCR後の増幅産物をqPCRで定量し、増幅前のヒトゲノムDNAの定量値（PC）およびC社製品での増幅産物の定量値と比較することで、PCRによる増幅バイアスの程度を確認した。
また、そのうち任意に選択した16ターゲットについて、マルチプレックスPCR後の増幅産物をqPCRで定量し、増幅前のヒトゲノムDNAの定量値（PC）およびC社製品での増幅産物の定量値と比較することで、PCRによる増幅バイアスの程度を確認した。
Coverage解析結果
| Number of mapped reads | 4,996,633 |
| Uniformity of amplicon coverage＊ | 94.2％ |
| Amplicons with at least 500 reads | 100％ |
| * | The percentage of bases in all targeted regions (or whole genome) covered by at least 0.2X the average base read depth |
| 約500万リードの解析において、207ターゲットすべてで500リード以上シーケンスできており、全ターゲットがきちんと増幅できていることが確認できた。 | |
| ・鋳型 | ： | ヒトゲノムDNA 20 ng | ||
| ・Primer | ： | Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 （Thermo Fisher Scientific社） |
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| ・PCR試薬 | ： | 本製品（製品コード RR062A）
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| ・PCR条件 | ： | 94℃ 1分 →（94℃ 30秒／60℃ 4分）×17 cycles →72℃ 10分 |
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| ・NGS | ： | Ion 318 Chip / Ion PGM Sequencer （Thermo Fisher Scientific社） |
マルチプレックスPCR後の遺伝子増幅の確認
＊NDは検出限界以下を示す （弊社比較データ）
| 本製品の増幅産物からは16種すべてのターゲットでCt値が得られ、検出できないターゲットも見られるC社製品の増幅産物と比較して、バイアスの少ない増幅ができていることが示唆された。 |
| ・qPCRの鋳型 | ： | PCR増幅産物の1,000倍希釈液 1 μl / 25 μl反応系 （PC ； ヒトゲノムDNA 100 ng / 25 μl反応系） |
| ・qPCR試薬 | ： | MightyAmp for Real Time （TB Green Plus) （製品コード R075A） |
| ※ C社製品のマルチプレックスPCRは推奨条件で反応 | ||
