NucleoBond^® Xtra Midi/Maxi EF

	試薬の準備	Resuspension Buffer RES-EF（＋RNase A）＊1, 70％エタノール＊2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
1～3	培養液の調製 集菌	培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。 　培養液の液量（V）＝400/ OD600 (ml) ＊3 培養液を、4℃、4,500～6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。
4～5	菌の溶解	菌ペレットを、Resuspension Buffer RES-EF（＋RNase A）＊1 8 ml＊4 に完全に懸濁する。 Buffer LYS-EF 8 ml＊4 を菌懸濁液に加え、5回倒置撹拌する。ボルテックスをしてはならない。 室温で、5分間静置する。
6	カラムの平衡化	カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU-EF 15 mlで平衡化する。 図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。 フィルター全体が湿っていることを確認する。
7	中和	Buffer NEU-EF 8 ml＊4 を、3の細胞懸濁液に加え、直ちに10～15回倒置撹拌する。ボルテックスはしてはならない。 氷上で5分間静置する。
8	ライセートの清澄化とローディング	4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。 液を自然落下させてカラムを空にする。
9	カラムの洗浄（1回目）	Buffer FIL-EF 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。 図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
10	カラムフィルターの廃棄	カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
11	カラムの洗浄（2回目）	Wash Buffer ENDO-EF 35 mlで、カラムを洗浄する。
12	カラムの洗浄（3回目）	Wash Buffer WASH-EF 15 mlで、カラムを洗浄する。
13	溶出	Elution Buffer ELU-EF＊5 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。 溶出液を15 ml遠心チューブ（各自で用意）に集める。
14	沈殿	イソプロパノール（室温）を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。 5,000×g以上で15分以上室温以下（好ましくは15,000×gで30分間、4℃）で遠心する。 上清を注意深く除去する。
15	DNAペレットの洗浄と乾燥	70%エタノール（室温）2 mlを沈殿に加え、5,000×g（好ましくは15,000×g）以上で5分間、室温で遠心する。 エタノールをチューブから完全に除去する。 5～10分間乾燥する。（乾燥しすぎるとDNAが溶解しにくくなるので注意する。）
16	DNAの溶解	適量のBuffer TE-EFまたはH2O-EFで溶解する。

＊1	Buffer RES（＋RNase A）の調製法 RNase A（凍結乾燥品）のチューブに1 mlのBuffer RESを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RESのボトルに移す。
＊2	70％ エタノールの調製法（製品コード 740420.10（10回用）の場合） 70％ エタノールのラベルのボトル（9 mlのendotoxin-free water）に21 mlの96～100％ エタノールを添加し、混合する。
＊3	低コピープラスミドの場合は、培養液の液量（V）＝800/ OD600 (ml)
＊4	低コピープラスミドの場合は、16 ml
＊5	BACのようなサイズの大きなプラスミドを溶出する場合は、Elution Buffer ELUを50℃に加温しておくと、回収率が上がる。

＜注意＞
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。

＊2は、製品コード 740420.10（10回用）の場合の調製法です。
製品コード 740420.50（50回用）の場合の調製法は英文説明書をご参照ください