AAV2-ZsGreen1の調製

AAVpro Helper Free System (AAV2)（製品コード 6230）に含まれるpRC2-mi342とpHelper、およびpAAV-ZsGreen1 (製品コード 6231)を用い、AAVpro Helper Free System (AAV2)の標準プロトコールに従って、AAV2-ZsGreen1ウイルスベクターの調製を行った。

1. 前日に播種した293T細胞 (T-225 フラスコ、10本) にリン酸カルシウム法でプラスミドを導入した。
2. プラスミド導入から6時間後に2% FBSを含むDMEM培地に全量交換した。（40 ml/T-225フラスコ）
3. プラスミド導入から48時間後にフラスコあたり0.5 mlの0.5 M EDTA（pH8.0）を添加し、10分間処理後、細胞を剥離させた。

AAV2-ZsGreen1ウイルスの抽出、精製

AAVpro Purification Kit (AAV2)（製品コード 6232）を使用し、標準プロトコールに従い、AAV2-ZsGreen1ウイルスベクターの精製を行った。

4. 遠心回収した細胞ペレットをタッピングで十分にほぐし、10 mlのAAV Extraction Solution Aを添加した。
5. ボルテックスし、完全に細胞懸濁後、5分間静置した。
6. 再度ボルテックスした後に遠心し、上清を回収後にAAV Extraction Solution Bを1 ml添加した。
7. SD solutionを1 ml添加し、30分間、37℃で反応させ、遠心後、上清を精製前のAAV2-ZsGreen1ウイルス溶液とした。
8. Prepacked Columnをセットし、10 mlのEquilibration Bufferでカラムの平衡化を行った後に、7.で得られたAAV2-ZsGreen1溶液をカラムに添加した。
9. 10 mlのWashing Bufferでカラムの洗浄し、3 mlのElution BufferでAAV2-ZsGreen1ウイルス溶液を溶出した。
10. 溶出したAAV2-ZsGreen1溶液をキット付属のFilter DeviceとCollection Tubeを用いて、濃縮、脱塩し、最終的に約500 μlの精製AAV2-ZsGreen1ウイルスベクターを得た。

AAV2-ZsGreen1ウイルスのタイター測定

11. AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR)（製品コード 6233）を使用し、標準プロトコールに従い得られたAAV2-ZsGreen1ウイルスのゲノムタイターを測定した。最終的に2.4×10¹² vgの精製AAV2-ZsGreen1を得たことを確認した。

AAV2-ZsGreen1ウイルスベクターのマウス脳線条体への投与

12. AAV2-ZsGreen1ウイルスをPBSで1.86×10¹² vg/mlに希釈し、5 μl/pointで左右それぞれのマウス脳線条体へ定位脳手術的に投与した。
13. 27日後に麻酔下で固定液（4% パラホルムアルデヒドを含む溶液）により灌流固定後、脳を摘出し、さらに4時間固定液に浸漬した。
14. 凍結後、冠状で薄切し、切片を作製した。

ZsGreen1の発現を蛍光顕微鏡により観察したところ、線条体全体にわたって強い緑色蛍光が確認できた（図A：脳の冠状断の片側部分を示す）。また、軸索に沿ってベクターが淡蒼球に到達し、淡蒼球の神経細胞においてZsGreen1が発現している様子が確認できた（図B：図Aの四角で囲った部分の強拡大）。

図A	図B
Bar＝1 mm	Bar＝30 μm

データご提供：自治医科大学 神経内科学　村松 慎一先生