NucleoSpin® miRNA Plasma

血漿・血清からのmiRNA精製プロトコール

NucleoSpin miRNA Plasma（製品コード 740981.10、740981.50、740981.250）

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試薬の準備
　 rDNase溶液＊1，Buffer MW2＊2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
1．サンプルの準備
300 μlの血漿または血清サンプルを用意する＊3。90 μlのBuffer MLPを添加し、vortexで5秒間混合する。
室温で3分間静置する。
2. タンパクの沈澱
30 μlのBuffer MPPを添加し、vortexで5秒間混合する。
室温で1分間静置した後、11,000×g、3分間遠心してタンパク質を沈殿させる。
3. 上清の回収
上清をCollection tube（2 ml、蓋付）に移す。
4. イソプロパノールの添加
400 μlのイソプロパノールを添加し、vortexで5秒間混合する＊4。
5. カラムへの吸着
NucleoSpin miRNA Column（緑色のリング）をCollection tube（2 ml）にセットする。
4の溶液を添加し、室温で2分間静置する。
11,000×g、30秒間遠心する。ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
6. DNase処理（オプション）
DNAの混入が問題になる場合には、DNase処理によるDNAの分解を行う。
1回目の洗浄
Buffer MW2＊2　700 μlをカラムに添加し、11,000×g、30秒間で遠心する。ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer MW2＊2　250 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
DNAの分解
50 μlのrDNase溶液＊1を直接NucleoSpin miRNA Columnのメンブレンに添加し、蓋を閉めて、室温で15分間静置する。
7. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer MW1 100 μlをカラムに添加する。
11,000×g、30秒間で遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer MW2＊2　700 μlをカラムに添加する。
11,000×g、30秒間で遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
3回目の洗浄
Buffer MW2＊2　250 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
8. DNAの溶出
カラムを新しいCollection Tube（1.5 ml）にセットする。
RNase-free H2O　30 μl＊5をカラムに加え、室温で1分間静置する。
蓋を閉めて11,000×gで1分間遠心してRNAを溶出する。
＊1：rDNase溶液
製品コード 740981.10（10回用）の場合：rDNase 1 vialにReaction Buffer for rDNase 3 mlを加え、室温で1分インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、－20℃に保存する（6ヵ月間安定）。凍結融解は3回までとする。
＊2： Buffer MW2
製品コード 740981.10（10回用）の場合：Wash Buffer MW2(Concentrate) 6 mlに96～100％エタノール24 mlを添加する。このBufferは室温で1年以上安定である。
＊3： サンプル量
300 μl以上の血清・血漿を使用する場合（900 μlの血清、血漿まで処理可能）には、その使用量に比例して、以降のステップのBuffer MLP, Buffer MPP, イソプロパノールの使用量を増やす。また、この場合、ステップ5で一度にカラムに添加できないため、このステップを繰り返すことですべての試料をカラムに添加する。
＊4： イソプロパノール添加時に2 μgのGlycogen、5 μgのlinear polyacrylamide等のキャリアを添加すれば若干の収量アップが期待できるが、通常は必要ない。Poly A RNAの添加は、キャリアとしての効果がなく、後のRNA定量に影響を与えるため避けること。
＊5： 溶出液量を変更することは可能であるが、収量や濃度が変わるだけでなく、溶出されるRNA鎖長にも影響を与える。液量が少ない場合(20 μl)は短鎖RNAだけが溶出され、多い場合(50 μl)は長鎖のRNAやDNAが溶出される傾向がある（英文説明書参照）。


＜注意＞
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。

＊1、＊2 は、製品コード 740981.10（10回用）の場合の調製法です。
製品コード 740981.50（50回用）,740981.250（250回用）の場合の調製法は英文説明書をご参照ください。

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