食品からの腸管出血性大腸菌検査のためのDNA抽出プロトコール
NucleoSpin Tissue（製品コード 740952.10、740952.50、740952.250）
使用時には必ず取扱説明書をご確認ください。
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1. サンプルの準備
マイクロチューブに増菌培養液*1 0.1 mlを入れ、10,000×gで10分間遠心して上清を除去し、細菌のペレットを用意する。
2. Proteinase K処理
Buffer T1 180 μl, Proteinase K溶液*2 25 μlを細菌のペレットに添加し、激しく攪拌する。56℃で1時間インキュベートする。
注：1時間で溶解しなかった場合：56℃でのインキュベートを3時間（～一晩）まで延長し、完全に溶解する。
3. サンプルの溶解
サンプルを撹拌する。Buffer B3 200 μlを加えて、激しく撹拌した後、70℃で10分間インキュベートする。
不溶物が残る場合は11,000×gで5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。
4. エタノールの添加
96～100％エタノール 210 μlを添加し、よく混合する。
5. カラムへの吸着
NucleoSpin Tissue ColumnをCollection Tubeにセットする。
4.の溶液をカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨て、新しいCollection Tubeにカラムをセットする。
6. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer BW 500 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer B5*2 600 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
7. メンブレンの乾燥
カラムを、11,000×gで1分間遠心する。
8. DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ（1.5 ml：各自で用意）にセットする。
70℃に温めたBuffer BE*3 100 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したDNA溶液は、4℃、長期保存の場合は、－20℃で保存する。（凍結融解はできるだけ繰り返さない）
*1 培養液の調製法
「腸管出血性大腸菌O26、O103、O111、O121、O145及びO157の検査法について」（食安監発1120第1号、平成26年11月20日）に記載された方法で、増菌培養を行う。
「腸管出血性大腸菌O26、O103、O111、O121、O145及びO157の検査法について」（食安監発1120第1号、平成26年11月20日）に記載された方法で、増菌培養を行う。
*2 Proteinase K溶液、Buffer B5の調製法はNucleSpin Tissue（製品コード 740952.10）の取扱説明書に従ってください。
*3 Buffer BEの組成：5 mM Tris-HCl, pH8.5
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