Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System およびStepOnePlus™ Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法
TB Green Fast qPCR Mix（製品コード RR430S/A/B）
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
- 下記に示す PCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞試薬 使用量 使用量 最終濃度 TB Green Fast qPCR Mix（2×） 10 μl 25 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM *1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM *1 ROX Reference Dye（50×）or Dye II（50×）*2 0.4 μl 1 μl 1× template（＜100 ng）*3 2 μl 4 μl 滅菌精製水 6 μl 16 μl total 20 μl *4 50 μl *4 - 反応を開始する。
PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。（PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。）
＜Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞Stage 1：初期変性
Reps：1
95℃、30秒
Stage 2：PCR反応
Reps：40
95℃、5秒
60℃、10秒～15秒*
Stage3：Melt Curve
＜Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System＞シャトルPCR標準プロトコール
Holding Stage
Reps：1
95℃、30秒
Cycling Stage
Number of Cycles：40
95℃、3秒
60℃、12秒～15秒*
Melt Curve Stage
※使用上の注意
本製品に使用している変異型Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。 - 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
