LightCycler 96／LightCycler 480システムを用いる場合の操作方法
TB Green Fast qPCR Mix（製品コード RR430S/A/B）
※ 各機種の取扱説明書に従って操作してください。
- 下記に示す PCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞ 試薬 使用量 最終濃度 TB Green Fast qPCR Mix（2×） 10 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 0.4 μM *1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 0.4 μM *1 template（＜100 ng）*2 2 μl 滅菌精製水 6.4 μl total 20 μl - 反応を開始する。
PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。（PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。）
＜LightCycler 96＞
シャトルPCR標準プロトコールStage 1：初期変性
94℃、30秒 20℃／秒
1サイクル
Stage 2：PCR反応
94℃、5秒 20℃／秒
60℃、10秒 20℃／秒
40サイクル
Stage 3：融解曲線分析
95℃、0秒 20℃／秒
60℃、15秒 20℃／秒
95℃、0秒0.1℃／秒
＜LightCycler 480＞
シャトルPCR標準プロトコールDenature
94℃、30秒 （Ramp Rate 4.8℃/sec.）
1サイクル
PCR
Analysis Mode：Quantificatio
94℃、5秒 （Ramp Rate 4.8℃/sec.）
60℃、10秒 （Ramp Rate 2.5℃/sec.、Acquisition Mode：Single）
40サイクル
Melting
Analysis Mode：Melting Curves
95℃、5秒 （Ramp Rate 4.8℃/sec.）
60℃、1分 （Ramp Rate 2.5℃/sec.）
95℃ （Ramp Rate 0.11℃/sec.、Acquisition Mode：Continuous、Acquisitions：5 per℃）
1サイクル
Cooling 50℃、30秒（Ramp Rate 2.5℃/sec.）
1サイクル※使用上の注意
本製品に使用している変異型Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。 - 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
