CRISPR/Cas9によるTetプロモーターのノックイン
ヒトHEK293細胞のCCR5遺伝子※上流領域に、ゲノム編集による相同組換え（HR：homologous recombination）によりテトラサイクリン発現誘導システム（Tet-On 3G Inducible Expression System）の応答ベクターのプロモーター配列（PTRE 3G）をノックインし、CCR5遺伝子のTet発現誘導を行った（図1）。
ノックイン用のドナープラスミドをIn-Fusion Cloning Kit(製品コード 639633など)により構築した。さらにCCR5遺伝子上流領域を標的としたsgRNAを設計し、sgRNA発現プラスミドを作製した（図1下部）。
次に、ヒトHEK293細胞にドナープラスミド、sgRNA発現プラスミド、Cas9発現プラスミドをトランスフェクションした。
※HEK293細胞のCCR5発現量は、qRT-PCR解析で検出限界以下である。
図1．実験フローとドナープラスミドの構造、sgRNAの標的配列
トランスフェクション後、Puromycinによる薬剤選択により、ノックインされた細胞をクローニングした。得られた7クローンについて、ノックインにより予想されるDNA構造をPCR増幅で確認した（図2）。7クローン中5クローンで予想されたサイズのDNA断片の増幅が確認された。さらに1クローン（Clone #1）のPCR産物をシーケンスし、塩基配列が正しくノックインがされていることを確認した。
図2．ノックイン細胞クローンの標的部位のPCRとシーケンスによる確認
Tet発現誘導のために、Clone #1細胞に、Tet-Expressタンパク質（販売終了）を添加し、CCR5遺伝子を発現誘導した。Tet-Express添加後のCCR5遺伝子の発現量をqRT-PCRによって定量した（図3）。
Tet 3Gプロモーターをノックインした細胞では、Tet-Expressタンパク質による発現誘導により、CCR5遺伝子が発現誘導された。
図3．ノックイン細胞におけるCCR5遺伝子のTet発現誘導
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ノックイン用のドナープラスミドをIn-Fusion Cloning Kit(製品コード 639633など)により構築した。さらにCCR5遺伝子上流領域を標的としたsgRNAを設計し、sgRNA発現プラスミドを作製した（図1下部）。
次に、ヒトHEK293細胞にドナープラスミド、sgRNA発現プラスミド、Cas9発現プラスミドをトランスフェクションした。
※HEK293細胞のCCR5発現量は、qRT-PCR解析で検出限界以下である。
図1．実験フローとドナープラスミドの構造、sgRNAの標的配列
トランスフェクション後、Puromycinによる薬剤選択により、ノックインされた細胞をクローニングした。得られた7クローンについて、ノックインにより予想されるDNA構造をPCR増幅で確認した（図2）。7クローン中5クローンで予想されたサイズのDNA断片の増幅が確認された。さらに1クローン（Clone #1）のPCR産物をシーケンスし、塩基配列が正しくノックインがされていることを確認した。
図2．ノックイン細胞クローンの標的部位のPCRとシーケンスによる確認
Tet発現誘導のために、Clone #1細胞に、Tet-Expressタンパク質（販売終了）を添加し、CCR5遺伝子を発現誘導した。Tet-Express添加後のCCR5遺伝子の発現量をqRT-PCRによって定量した（図3）。
Tet 3Gプロモーターをノックインした細胞では、Tet-Expressタンパク質による発現誘導により、CCR5遺伝子が発現誘導された。
図3．ノックイン細胞におけるCCR5遺伝子のTet発現誘導
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