| 試薬の準備 |
|
rDNase溶液*1、Buffer RA3*2が添付の英文説明書に従って調製されていることを確認する。 |
|
| 1. サンプルの準備 |
 | 組織 | 30 mgの組織を用意する。液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、などの細分化処理を行う |
| 細胞 | 5×106個の培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合はディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。 |
|
| 2. サンプルの溶解 |  | Buffer RA1 350 μl（2-ME または1 M（～2 M）DTT 3.5 μlを添加）を組織または細胞に添加し、均一にホモジナイズする。
|
|
| 3. ライセートのろ過 |  | NucleoSpin Filter（紫のリング）をCollection Tube（2 ml）にセットする。
2のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、1分間で遠心する。
|  |
|
| 4. エタノールの添加 |
| NucleoSpin Filterを取り除き、ろ液に70％エタノール350 μlを添加し、よく混合する。
（スピンダウンは避ける。スピンダウンした場合は沈殿物も全て5のカラムに添加する。） |
|
| 5. カラムへの吸着 |  | NucleoSpin RNA Column（水色のリング）を用意する。
4の溶液をカラムに添加し、11,000×g、30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。 | |
|
| 6. メンブレンの脱塩 |  | MDB 350 μlをカラムに添加し、11,000×g、1分間で遠心する。 | |
|
| 7. DNase処理 |  | rDNase溶液*1 10 μlとReaction Buffer for rDNase 90 μlを混合し、DNase reaction mixtureを調製する。
DNase reaction mixture 95 μlをシリカメンブレンの中央へ直接添加し、室温（18～25℃）で15分間インキュベートする。 |
|
| 8. メンブレンの洗浄 |  | 1回目の洗浄
Buffer RAW2 200 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（2 ml）にセットする。 | |
2回目の洗浄
Buffer RA3*2 700 μl*3 をカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、再び同じCollection Tubeにセットする。 | |
3回目の洗浄
Buffer RA3*2 250 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
カラムを新しいCollection Tube（1.5 ml）にセットする。 | |
|
| 9. RNAの溶出 |  | RNase-free H2O 60 μlをカラムに加え、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したRNA溶液は、－20℃または－70℃で保存する。 | |
|
