NGS解析

ThruPLEX® DNA-Seq Kit Q＆A

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Q1　ThruPLEX DNA-Seq Kitと他社ライブラリー調製キットとの違いは？
A1　ThruPLEX DNA-Seq Kitは現在市販されているキットの中で最速かつ最高感度のライブラリー調製キットです。特許取得のエンドリペア、ライゲーション、増幅の簡単な3ステップで構成されており、全操作は1本のチューブ内で行われます。
・インプットDNA量：50 pg～ 50 ng
・精製ステップ：不要（PCR増幅後のみ）
・ライブラリー作製のステップ数：3
・ライブラリー作製時間：2時間
・サンプルを移す回数：0
Q2　ThruPLEX DNA-Seq KitはGCリッチ領域も均一なカバレッジが得られるか？
A2　 はい。ThruPLEX DNA-Seq KitはGCリッチ領域も均一なカバレッジが得られます。
Q3　ThruPLEX DNA-Seq Kitで変性／一本鎖DNAは使用できるか？
A3　 いいえ。ThruPLEX DNA-Seq Kitで使用するDNAは二本鎖でなければなりません。
Q4　DNA断片化は必要か？
A4　 はい。DNAサイズが＞1 kbの場合、ThruPLEX DNA-Seq Kitを使用する前に断片化する必要があります。
Q5　DNA断片化にはどんな方法が利用できるか？
A5　 DNA断片化は物理的（Covaris、Bioruptorなど）、または酵素的（DNA Fragmentation Kitなど）な方法が利用可能です。
Q6　Covarisによる断片化にはどのくらいの量のDNAが必要か？また、断片化するDNA溶液のバッファーの種類は？
A6　 断片化には2～50 ngのDNAを用います。バッファーは50～130 μlのLow TEバッファーが適当です。より少ないDNAを用いる場合は、"Low-volume DNA shearing for ThruPLEX library prep"を参照ください。
Q7　Covarisによる断片化はどんな条件で実施するか？
A7　 断片サイズに応じてCovarisの推奨条件を設定する必要があります。詳細はCovarisウェブサイトをご参照ください。
Q8　ThruPLEX DNA-Seq Kitで使用するgDNAをランダムに断片化するキットはあるか？
A8　 gDNAをランダムに断片化するDNA Fragmentation Kitが使用できます。使用方法はDNA Fragmentation Kitのユーザーマニュアルをご確認ください。
Q9　ThruPLEX DNA-Seq Kitの推奨DNAインプット量は？
A9　 ThruPLEX DNA-Seq Kitは50 pg～50 ngのインプットDNAを増幅するように設計されています。インプット量は、必要とされる多様性のレベルや用途に依存します。
Q10　インデックスキットを使用する必要はあるか？マルチプレックス解析にはどのインデックスを使用するとよいか？
A10　 はい。別売りのインデックスキットを購入する必要があります。チューブまたはマイクロウェルプレートで提供され、イルミナNGS対応のインデックス配列を含む増幅プライマーで構成されています。ThruPLEX DNA-Seq Kitのライブラリー増幅反応で使用する必要があります。
Q11　ライブラリー増幅の最適なPCRサイクル数の決定に推奨される方法は何か？
A11　 ライブラリー増幅に最適なPCRサイクル数の決定方法は、ThruPLEX DNA-Seq Kitのユーザーマニュアルをご確認ください。
Q12　リアルタイムPCR装置なしでThruPLEX DNA-Seq Kitを使用できるか？その場合、PCRサイクル数をどのように決めるのか？
A12　 はい。ThruPLEX DNA-Seq KitはリアルタイムPCR装置がなくても使用できます。最適なPCRサイクル数はユーザーマニュアルに記載されている表を参考に、DNAインプット量に基づいて選択してください。
Q13　ThruPLEX DNA-Seq Kitで調製したライブラリーの濃度または収量が低い場合に追加増幅を行うことはできるか？
A13　 はい。ThruPLEX DNA-Seq Kitライブラリーは、4℃で最大6時間、または-20℃で最大7日間保存後、試薬を追加することなくさらに増幅することができます。ライブラリー処理ワークフローについてはThruPLEX DNA-Seq Kitユーザーマニュアルを、追加増幅サイクルの手順やワークフローについてはThruPLEX DNA-Seq Kitのユーザーマニュアルをご参照ください。
Q14　ThruPLEX DNA-SeqライブラリーをAMPure XPで精製した後追加増幅できるか？
A14　 いいえ、できません。
Q15　ThruPLEX DNA-Seq Kitで作成したライブラリーはどれくらいの収量が期待できるか？
A15　 ライブラリーの収量はサンプルの種類、断片化サイズ、使用するサーマルサイクラー等によって異なりますが100 ng～1 μgです。Covarisで断片化した平均サイズが200 bpのreference DNAを推奨サイクル数で増幅した場合の収量は300～700 ngです。
Q16　AMPure XPによる精製の前後でThruPLEX DNA-Seqライブラリーの定量を行う必要があるか？
A16　 いいえ。シーケンス前のみ、個別またはプールされたライブラリーの定量が必要です。ライブラリー増幅反応後にライブラリー定量するとAMPure XP精製ステップでDNAがロスする可能性があるため、シーケンス前の精製後のライブラリーを定量することをお勧めします。
Q17　ThruPLEX DNA-Seq Kitで調製したライブラリーをAMPure XPで精製する際、特別に考慮することはあるか？
A17　 はい。ビーズ：サンプル比は1：1で使用することを推奨します。全ての洗浄ステップで使用する80％エタノールは用事調製したものをご使用ください。詳細はユーザーマニュアルをご参照ください。
Q18　ThruPLEX DNA-Seq Kitで調製したライブラリーのシーケンスにはどのイルミナNGSシステムが使用できるか？
A18　 ThruPLEX DNA-Seq Kitで調製したライブラリーは、NovaSeq、HiSeq、MiSeq、NextSeq 等、全てのイルミナNGSプラットフォームに対応しています。
Q19　どれくらいの濃度のThruPLEX DNA-Seqライブラリーをフローセルにロードすればよいか？
A19　 ご使用のフローセルの最適ローディング濃度については、イルミナ社の推奨に従ってください。MiSeq v3でのシーケンスには、14～15 pMのThruPLEX DNA-Seqライブラリーをロードすることを推奨します。
Q20　ThruPLEX DNA-Seqライブラリーをフローセルにロードする際、特別なステップは必要か？
A20　 いいえ。特別なステップは不要です。ThruPLEX DNA-Seqライブラリーは、TruSeq Nano DNA Sample Prepキット等のイルミナNGS用ライブラリー作製キットと同様に使用できます。
Q21　フローセルにロードする前に、PhiXをライブラリーにスパイクすることを推奨するか？
A21　 イルミナ社のPhiX使用方法に従ってください。多様性の低いライブラリー、またはシーケンスに問題がある場合は、PhiX濃度を上げる必要があります。シーケンスに関するその他の推奨事項については、ThruPLEX DNA-Seq Kitのユーザーマニュアルをご参照ください。

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