ヒト由来cDNAを鋳型としたqPCR反応比較(2)
方法
ヒト由来cDNAを鋳型として各社高速反応タイプのリアルタイムPCR試薬を用いて反応を行った。
使用機器： Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960：終売）
弊社試薬： PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)（製品コード RR037A/B）
TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）
Template： HL60 total RNA
Primers ： Perfect Real Timeサポートシステム（PRTSS） for インターカレーターで設計
qPCR反応組成 ＜1反応あたり＞
使用機器： Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900/TP960：終売）
弊社試薬： PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)（製品コード RR037A/B）
TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B）
Template： HL60 total RNA
Primers ： Perfect Real Timeサポートシステム（PRTSS） for インターカレーターで設計
＜リアルタイム反応条件＞
Holding
1 cycle
95℃、30秒
2 Step PCR
40 cycles
95℃、5秒
60℃、30秒
Dissociation
1 cycle
95℃、30秒
2 Step PCR
40 cycles
95℃、5秒
60℃、30秒
Dissociation
qPCR反応組成 ＜1反応あたり＞
| 試薬 | 使用量 | 最終濃度 |
|---|---|---|
| TB Green Premix Ex Taq （2×） | 12.5 μl | 1× |
| PCR Forward Primer（10 μM） | 0.5 μl | 0.2 μM |
| PCR Reverse Primer（10 μM） | 0.5 μl | 0.2 μM |
| Template(cDNA合成反応液） | 2 μl | |
| 滅菌精製水 | 9.5 μl | |
| total | 25 μl |
結果
TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) は他社の同タイプ（高速反応タイプ）に比べて非特異的増幅が起こりにくく、より正確な定量が可能であった。
