SMART-Seq^® v4 Ultra^® Low Input RNA Kit for Sequencing

mRNAの全長配列の解析を行うために、全長cDNAの合成用のキットであるSMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for SequencingとMinIONを用いてcDNA-Seqを行った。

50 ngの肺腺癌細胞株H1975由来のtotal RNAから、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing (製品コード 634888、以降SMART-Seq v4とする)を用いて、cDNAの合成を行った。SMART-Seq v4に用いられているオリゴdTプライマー及び、PCRプライマーは5'末端がブロックされているため、ナノポアシーケンス用のアダプターのライゲーションに影響が出る。そのため、それらのプライマーをSmart-Seq2の配列のカスタムオリゴDNAで代用した。cDNA合成はSMART-Seq v4のプロトコールに従って行い、cDNA増幅のためのPCRは16サイクル行った。ナノポアシーケンスのライブラリー調製は、1.5 μgのcDNAと1D² Sequencing Kit (オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社、SQK-LSK308)を用いて、1D² sequencing of genomic DNA (with SQK-LSK308)のプロトコールを改変した方法により行った。元のプロトコールでは、長鎖のゲノムをターゲットとしているため、2回のライゲーションそれぞれの後のAgencourt AMPure XP精製を5：2 (サンプル：Agencourt AMPure XP)の比率で行うが、cDNAは短いため、1：1で行った。調製したライブラリーをFlow Cell R9.5 (オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社、FLO-MIN107)とMinIONでシーケンスした。

50 ngのtotal RNAからSMART-Seq v4を用いてcDNAを調製したところ、4 μg程度（80 ng/μl、50 μl）の全長cDNAを得ることができた。

	リード数	平均長	マップ数
1d reads	2,580,092	1,389	1,900,971 (73.7％)
1dsq pass reads	23,390	1,857	23,341 (99.8％)
1dsq fail reads	233,190	1,254	- *

＊ 1dsq fail readについて、マッピングを行わなかった。

1D²シーケンスの結果、1d readは1 runで258万リード得られた。また、シーケンスクオリティの高い1dsq pass readも2万リード程度得られた。平均長は1～2 kb程度と長いリードが得られた。リードをminimap2でアラインメントを行ったところ、1d readは73.7％、1dsq pass readは99.8％がリファレンスゲノムにマップされた。

SMART-Seq v4で調製した全長cDNAをNextera XT(イルミナ社)を用いてライブラリー調製し、イルミナ社次世代シーケンサーで解析した。イルミナ社次世代シーケンサーから得られた発現定量結果とMinIONの結果を比較したところ、R＝0.93と非常に高い相関係数を示し、MinIONを用いた場合でも定量性の高いデータを取得できた。

AKT1は3種類のRefSeq transcriptが存在するが、四角（赤）で囲ったtranscriptが主に発現していることが確認でき、遺伝子の全長にわたってマップしていることが示された。

今回の実験に用いたH1975細胞は同一染色体上に、C→Tの変異とT→Gの変異が存在することが知られている。本実験では両方の変異を持ったリードが6本検出され、ヘテロに染色体上に存在する体細胞変異のフェージング解析が可能であることが示された。

SMART-Seq v4とMinIONを組み合わせることにより、少量のtotal RNAからcDNA-Seqが行えることが確認できた。