NGS解析

―大倉先生のご研究内容についてお教えください。

メインテーマは、制御性T細胞（Treg）の発生分化に関する研究です。Tregは胸腺で発生・分化が進行しますが、まだそのメカニズムには不明な点が多くそれを明らかにしたいと思っています。

―TregのNGS解析（RNA-Seq）で微量サンプルに強い弊社SMART-Seq v4を取り入れられていますが、その理由・きっかけをお教えください。

マウス胸腺中での発生過程のTregは非常に細胞数が少なく、マイナー分画では1,000個を下回る場合もありますので、微量サンプルから高解像度で解析できる系が必要となってきます。そこで微量サンプルからでも通常のRNA-Seqと同レベルの解析ができる系を色々と試していました。
最初は別の微量解析系を使用していましたが、何年か前のNGS現場の会でうちのラボの中村さんがタカラバイオ展示ブースでの抽選会でSMART-Seq v4を当てたことがきっかけで試してみました。

―SMART-Seq v4を使用したRNA-Seq解析の結果はいかがだったでしょうか。

とても良い結果でした。ステップ数の少ないシンプルなプロトコールでcDNA合成ができるので、結果が安定しました。バラツキも少なく、感度も良く、検出できる遺伝子数も以前行っていた方法より上回っていました。価格が高いのがネックですが、知ってしまったら使わざるを得なくなってしまいました（笑）。

―SMART-Seq v4のデメリットはありますでしょうか。

先程も言いましたが、価格が高いことです。ですのでうちのラボでは、使用する試薬量を減らしたり、取得するリード数を落とすなどして、コストダウンを行っています。
価格のゼロが1個少なくなれば、もっと売れると思います（笑）。

―SMART-Seq v4を使用される中で、何か工夫された部分はありますか？

がん細胞やfibroblastなどの一般的な細胞であれば問題ないのでしょうが、私たちが対象にしているT細胞は非常にcell lysisが難しく、またRNA量が少ないため、キットに添付されているLysisバッファーを使用しての溶解法では結果がばらついてしまい、うまくいきませんでした。そのため、グアニジンを使用して細胞を溶解し、ビーズでRNAを回収・精製することで、結果が抜群に安定するようになりました。

―まだSMART-Seq v4を使われたことがない方に、お勧め点などコメントをお願いいたします。

シングルセルでは多少ばらつくこともありますが、T細胞で1,000細胞以上、一般的な細胞で100細胞以上あれば良好な結果が得られると思います。プロトコールがシンプルで、誰がやっても安定した結果が得られることがSMART-Seq v4のメリットだと思います。

ナイーブT細胞を使用し、SMART-Seq v4と他社同タイプキットの比較実験および再現性の確認を行った。細胞数は、SMART-Seq v4が1,000細胞、他社同タイプキットは100,000細胞を使用した。

1）SMART-Seq v4と他社同タイプキットのマッピングパターンの比較

2）SMART-Seq v4の再現性の確認

SMART-Seq v4を使用したナイーブT細胞1,000個からのRNA-Seq解析を2回行い、各遺伝子発現プロファイル結果をプロットし、相関性を確認した。