NucleoSpin^® VET

動物の糞便試料は生物種や状況により、固さや水分含量、阻害物の含有量など様々です。このため、最適な核酸抽出方法は各試料において異なります。このプロトコールで示された方法は一例です。うまくいかない場合は個々に検討してください。
固まった糞便などは機械的にほぐす必要があります。また糞便の水分含量により、添加するPBSの量を加減する必要があります。阻害物の含有量の多い糞便には、使用する試料量を減らすなど、個々の糞便に対応した変更を行ってください。

Buffer SVW2^*1が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認します。
また、Carrier RNA^*2がRNase-free H₂Oで溶解されていることを確認します。
RNase-free H₂Oを70℃に予温しておきます。
PBSを用意しておきます。

糞便試料に10倍量のPBSを加えて、混合します。
2,000×gで1分間遠心します（回転数や時間を延ばさないでください）。
浮遊物をなるべく取らないように上清250 μlを別のチューブに移します。
Buffer SVL 250 μlを加えて、vortexで30秒間混合します。
スピンダウンを行ってLiquid Proteinase K 10 μlを添加します。
振盪機を用いて1,400 rpmで室温10分間混合します。
（オプション）スピンダウンを行い、2.5 μlのCarrier RNA溶液を加えます。Vortexなどで混合した後、3分間室温で静置します。
約15,000×gで3分間遠心し、沈殿物を取らないようにして400 μlの上清をCollection Tube（1.5 ml）に移します。

1．の溶液をスピンダウンした後、200 μlのエタノール（96～100％）を加えて素早く混合します。
室温で5分間静置します。
スピンダウンして溶液を落とします。

NucleoSpin VET Columnを2 ml Collection Tubeにセットします。
2．の溶液610 μlをカラムに添加し、4,000×g、3分間遠心します^*3。
ろ液を捨てた後、新しい2 ml Collection Tubeにカラムをセットします。

70℃に予温したRNase-free H₂O 100 μlを添加し、3分間室温で静置します。
20,000×gで3分間遠心し、核酸を溶出します。