再生／細胞医療・遺伝子治療支援

CAR（キメラ抗原受容体）-T細胞療法は、がん抗原を特異的に認識するCAR遺伝子を患者由来のT細胞に導入し、再び患者に輸注する治療法です。
一般的にCAR-T細胞製造には7～14日間を要しますが、長期培養によりT細胞の分化・疲弊を招いて治療効果が減弱するだけでなく、製造コストの上昇も課題になります。
タカラバイオでは、高機能CAR-Tをより短期間に製造するためのSpo-T法をこれまでに開発していますが、よりシンプルかつ低コストな手法への改良を進めています。
今回、浮遊細胞の高密度培養が可能なガス透過性培養容器『G-Rex』を用いたCAR-T細胞製造法の構築を試みました。

1. 従来のCAR-T製造
   



2. G-Rexを用いた簡便なCAR-T製造
   
   

【実験結果】

1. G-Rexを用いたCAR-T細胞の性能評価
   
   1. T細胞増殖とCAR陽性率
      CD3/CD28 beads刺激と比較して、RetroNectinと抗CD3抗体による共刺激（RN/OKT3刺激）、あるいはCD3/CD28 beads刺激時にRetroNectinコーティングを併用することで増殖率が向上した（図a）。また、T細胞刺激と同じタイミングでレンチウイルスベクター感染を開始した場合（Day 0 LV transduction）、RetroNectinを併用した場合に高いCAR陽性率が得られた（図b）。
      

      a. T細胞増殖

      

      b. CAR陽性率

      
   2. 免疫表現型
      刺激法によってCAR-T細胞の免疫表現型にはバラエティが見られ、RN/OKT3刺激法の場合に、Naive細胞分画を含む未分化なCAR-T細胞が最も高い割合で維持されていた。
      
      免疫表現型
      
2. G-Rex × Spo-Tで製造したCAR-Tの性能評価
   レンチウイルスベクターで遺伝子導入後、10日目で回収した細胞（従来法）と2日目で回収した細胞（Spo-T法）の性能を比較した。
   1. CAR陽性率
      Spo-T法で製造した細胞のCAR陽性率は、従来法と同等であった。
      
   2. 免疫表現型
      Spo-T法は、従来法に比べて、未分化（Naïve）なCAR-T細胞の割合が高かった。
      
   3. 腫瘍細胞に対するCAR-T細胞の反応性
      CAR-T細胞と腫瘍細胞(Nalm-6-GFP-Luc) をウェルプレート中で共培養し（E/T=0.1, n=3)、 翌日(Day 1) および、4日後（Day 4）にフローサイトメトリー解析により、CD3陽性T細胞数・腫瘍細胞数を計測した。その結果、Spo-T法で製造したCAR-T細胞は腫瘍細胞と共培養した際に、従来法CAR-T細胞よりも著しい増殖性と強力な細胞傷害活性を示した。
      
      

      

以上より、G-Rexを用いたCAR-T細胞作製において、RN/OKT3刺激によりT細胞刺激とCAR遺伝子導入を同時に行うことで高効率にCAR-T細胞が得られること、さらに、短期間製造法であるSpo-T法も適用できることが実証されました。

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