CHOgro^® High Yield Expression System

A1　培養とトランスフェクションに必要な試薬が全て含まれています。

• CHOgro Expression Medium（製品コード MIR6200　2×1 L）
• 培地添加剤：Poloxamer 188（製品コード MIR6230　100 ml）、L-Glutamine (製品コード MIR6240　100 ml)
• TransIT-PRO Transfection Reagent（製品コード MIR5740　1.0 ml）
• CHOgro Titer Enhancer (20 ml)
• CHOgro Complex Formation Solution（製品コード MIR6210　100 ml）

CHOgro Titer Enhancer以外のコンポーネントは単品でもご購入いただけます。
CHOgro Titer Enhancerは、CHOgro High Yield Expression System（製品コード MIR6270）、またはCHOgro Transfection and Titer Enhancer Kit（製品コード MIR 6225）に含まれています。

A2　それぞれのコンポーネントの保存方法は以下の通りです。
CHOgro Expression Medium：4℃　※遮光してください。
CHOgro Complex Formation Solution：4℃　※遮光してください。
CHOgro Titer Enhancer：2～10℃　※遮光してください。
L-Glutamine Solution, 200 mM：－20℃　※凍結融解の繰り返しは避けてください。
Poloxamer 188 Solution, 10％：室温
TransIT-PRO Transfection Reagent：－20℃

A3　CHOgro Expression Mediumの組成は非公開です。加水分解物や動物由来成分は含まれておらず、既知成分のみで構成されています。ISOを準拠した施設でcGMP準拠のプロセスによって製造されています。

A4　はい。キットに含まれるL-Glutamine Solution（20 ml/L, 終濃度4 mM）とPoloxamer 188 Solution（30 ml/L,　終濃度0.3％）の添加が必要です。

A5　TransIT-PRO Transfection Reagentの組成は非公開です。動物由来成分は含まれておらず、浮遊培養のCHO細胞とHEK293細胞で高いトランスフェクション効率を発揮するように開発された脂質ポリマーの混合物です。

A6　TransIT-PRO Transfection Reagentは陽電荷を持っており、陰電荷を持つDNAと複合体を形成します。その複合体が陰電荷を帯びた細胞表面に引きつけられ、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれます。

A7　CHOgro Titer Enhancerの組成は非公開です。既知成分で構成された動物由来成分不含の試薬で、抗体産生の細胞内プロセスを調節して産生量を増加させます。
CHOgro Titer Enhancerは、単品販売はしておらず、CHOgro High Yield Expression System（製品コード MIR6270）、またはCHOgro Transfection and Titer Enhancer Kit（製品コード MIR6225）のコンポーネントとして販売されています。

A8　Mirus Bio社ではFreeStyle CHO-S、ExpiCHO-S Cells (ThermoFisher Scientific)、および浮遊培養に馴化されたCHO-K1について使用できることを確認しています。
また、CHOK1SVおよびCHOZN-GS細胞を試したユーザー様から使用可能という情報を得ています。

A9　はい、使用可能です。CHOgro Expression MediumにはL-グルタミンは含まれておらず、通常は4 mM L-グルタミンを添加して使用します。CHO-GS選択システムを使用する場合は、グルタミン合成酵素発現プラスミドをトランスフェクションした後はL-グルタミンを添加せずにCHOgro Expression Mediumを用います。

A10　いいえ、適していません。CHOgro Expression Mediumにはヒポキサンチンとチミジンが含まれているため、DG44細胞やDUX細胞の選択に使用することができません。

A11　トランスフェクション後7日目の観察で、CHOgro High Yield Expression SystemはExpiCHO Expression Systemの同等、またはそれ以上の抗体産生が見られます（ExpiCHO-S細胞もCHO-S細胞についてもCHOgro High Yield Expression Systemを用いて同様の結果が得られています）。
比較データは、CHOgro High Yield Expression Systemをご覧ください。

A12　それぞれの培地に馴化したCHO-S細胞を用いて比較すると、通常、CHOgro High Yield Expression SystemはFectoCHO Expression Systemの5倍の抗体タンパク質産生量が見られます。

A13　CHOgro Expression Mediumは、無血清、既知成分のみで構成された栄養成分がリッチな培地で、浮遊培養CHO細胞の高密度培養とラージスケールのトランスフェクションが可能です。細胞の馴化が容易で、他の培地で必要とされる適応プロセスは不要です。
CHOgro Expression MediumとTransIT-PRO Transfection ReagentおよびCHOgro Enhancerを組み合せることにより、強力な細胞増殖と高効率なトランスフェクションが可能となり、一過性のトランスフェクションによる高発現プロセスを実現します。

A14　タンパク質収量は、発現させるタンパク質の性質や発現ベクターの構造に大きく依存します。IgG抗体の発現量、および製品比較はCHOgro High Yield Expression Systemをご覧ください。

A15　はい。CHOgro High Yield Expression Systemの全てのコンポーネントは動物由来成分を含んでいません。

A16　ベストな結果を得るために、CHOgro High Yield Expression System に含まれるCHOgro Complex Formation Solutionの使用をお勧めします。無血清培地の中には、ヘパリン、硫酸ポリデキストランなどのポリアニオンが含まれているものがあり、複合体の形成を阻害する可能性があります。

A17　トランスフェクション用の細胞培養を開始する18～24時間前に、他の培地（FreeStyle CHO Expression Medium, ExpiCHO Expression Mediumなど）で培養した細胞を300×gで5分間遠心し、4 mM L-Glutamineと0.3％ Poloxamer 188を添加したCHOgro Expression Mediumに再懸濁します。馴化時間は延長することも可能です。細胞が18～24時間毎に分裂し、トリパンブルー染色で98％以上の生存率を示す状態を完全に馴化した状態と考えることができます。

A18　浮遊培養CHO細胞（CHO-S、ExpiCHO-Sなど）は4×10⁶ cells/mlの細胞密度でトランスフェクションすることをお勧めします。経験上、それより高い細胞密度で行っても高い発現量は得られませんでした。

A19　最初はTransIT-PRO Reagent：DNA=1:1（1 mlあたりTransIT-PRO Reagent　1 μl、DNA　1 μg）で使用することをお勧めします。その場合、1 Lの培養にはTransIT-PRO Transfection Reagentが1 ml、DNAが1 mg必要です。

A20　カチオン性の抗生物質はTransIT-PRO ReagentとDNAの複合体形成を阻害します。そのため、複合体形成時は抗生物質を加えないことをお勧めします。一旦、トランスフェクション複合体が形成された後は、低濃度の抗生物質を含む完全培地で培養した細胞に複合体を添加することが可能です（例：100X stock of penicillin/streptomycinを希釈して終濃度0.1×～1×濃度で使用）。

A21　はい、32℃へのシフトを強くお勧めします。通常、細胞にトランスフェクション複合体とCHOgro Titer Enhancerを添加した後に培養温度を32℃にシフトすると、少なくとも2倍のタンパク質産生量が得られます。培養温度をシフトすることができない場合は、高温の培養でタンパク質が分解される可能性があるため、培養日数を3～5日に短縮することをお勧めします。

A22　通常、トランスフェクション後0～24時間の間に培養温度を37℃から32℃にシフトすることによってタンパク質の収量が2倍に増えます。ターゲットによっては2倍を超える増加が見られます。低い温度の条件ではタンパク質はあまり急激には分解しないため、一般に32℃培養は質の高いタンパク質が得られると言われています。

A23　トランスフェクション後の最適培養日数は、細胞ごとに検討して決定することをお勧めします。最適な培養日数は実験の目的と使用するプラスミドの性質によって異なります。分泌型の抗体発現の場合、バッチ培養で32℃、7～14日の培養が適しています。37℃培養の場合は、培地中の栄養成分の枯渇によって細胞の生存率が低下するため、5～7日間の短い培養日数をお勧めします。

A24　CHOgro High Yield Expression Systemは、高タイターの一過性のタンパク質発現用にデザインされていますが、安定発現細胞株作製にも使用できます。

A25　Mirus社では、コントロールプラスミドとしてHuman IgG1 Expression Control（製品コード MIR6250）を販売しています。CMVプロモーターによってコドン最適化されたヒトIgGの重鎖と軽鎖を発現するプラスミドが1：1のモル比で混合されています。CHOgro High Yield Expression Systemの推奨プロトコールに従って、適切な細胞密度でコントロールプラスミドをトランスフェクションし、CHOgro Titer Enhancer addition添加後32℃で7日間培養すると、通常、400 mg/L以上の収量が得られます。

A26　トランスフェクション効率やタンパク質収量には様々な要因が関わっています。トラスフェクション効率を改善し、最終的なタンパク質収量を上げるために重要なポイントを列挙します。
User ProtocolのTroubleshooting Guideもご参照ください。

• トランスフェクション時の細胞密度
  通常、トランスフェクション時の細胞密度は4×10⁶ cells／mlが望ましいですが、実験目的によってはこれより高い細胞密度、あるいは低い細胞密度が必要となる場合もあります。トランスフェクションの18～24時間前に細胞を継代し、活発に細胞分裂している状態が理想的です。
• TransIT-PRO Transfection ReagentとDNAの比
  DNA 1 μgに対して0.5～2 μlの範囲で条件を検討し、最適な比を求めてください。
• DNAの純度
  トランスフェクションに使用するDNAは、高純度で無菌的、エンドトキシンなどの混入がないものをご使用ください。 MiraCLEAN Endotoxin Removal Kit（製品コード MIR5910／MIR5900）を用いると、DNA溶液に混入している微量のエンドトキシン（LPS）を除去することができます。
• トランスフェクション後の培養時間
  トランスフェクション後24時間以内に（0～24時間）培養温度を32℃にシフトした培養では、培養日数を延長すると（例：10～14日）タンパク質の質に影響を与えることなくタンパク質の収量を大幅に向上することがあります。抗体や分解されやすいタンパク質などは温度シフト後の培養時間はやや短い5～7日程度が適当な場合もあります。
  培養のスケールアップを行う前に最適な発現パラメーターを決めることが重要です。
• トランスフェクションの温度シフト
  トランスフェクション後24時間までに培養温度を37℃から32℃にシフトすると通常タンパク質の収量が2倍に上昇し、いくつかのターゲットでは2倍を超える収量の増加が見られます。低い温度の条件ではタンパク質の分解が遅くなるため一般に32℃の培養では質の高いタンパク質が得られます。
• 培養時の振盪／回転条件
  過度の撹拌は細胞に有害となるため、トランスフェクション前の培養は、37℃、8％ CO₂で適切な回転数（例：振幅1.9 cm, 125 rpm）で培養することをお勧めします。細胞の増殖が悪くトリパンブルー染色による生存率が98％以上でない場合はトラスフェクションに進まないでください。

A27　可能です。ただし、添加するサプリメントがトランスフェクションを阻害しないかどうか確認するために、トランスフェクション条件のテストをお勧めします。
細胞の長期培養や目的タンパク質収量の向上のためにトランスフェクションを阻害するサプリメント（例：高カチオン性、高アニオン性）の添加が必要な場合は、トランスフェクションの4時間後に添加することが可能です。