TaKaRa PCR Human Papillomavirus Typing Set

Standard Protocol
 (TaKaRa PCR Human Papillomavirus Typing Set)

(1)ゲノムDNAの調製

  1. 生検組織等を以下の反応液組成(Total 300 μl)で、37℃で12時間Proteinase K処理する。
    10 mM  Tris-HCl(pH8.0)
    5 mM  EDTA
    0.5%  SDS
    0.2 mg/ml  Proteinase K

  2. Proteinase K処理したサンプルに300 μlのフェノール/クロロホルム溶液を加えて混合し、12,000 rpm、10分間遠心して水層(上層)を別のチューブに移す。
  3. 300 μlのクロロホルム/イソアミルアルコール溶液を加えて混合し、12,000 rpm、10分間遠心して水層(上層)を別のチューブに移す。
  4. エタノール600 μl、3 M酢酸ナトリウム30 μlを加え、-20℃で1時間(または-70℃で30分間)放置した後、12,000 rpm、10分間遠心して沈殿を回収する。
  5. 沈殿を80%エタノールでリンスし、乾燥させた後、ゲノムDNAを滅菌水に溶解する。

(2)PCR

  1. 反応液の調製
    TaKaRa Taq(製品コード R001A/B/C)を用いて反応液を調製する。
    ● 悪性型HPV DNAの増幅
    10×PCR Buffer*5 μl
    dNTP Mixture(各2.5 mM)*4 μl
    HPVpU-1M0.5 μl
    HPVpU-2R0.5 μl
    TaKaRa Taq(5 U/μl)0.25 μl
    試料ゲノムDNA0.5 μg
    滅菌精製水up to 50 μl

    ● 良性型HPV DNAの増幅

    10×PCR Buffer*5 μl
    dNTP Mixture(各2.5 mM)*4 μl
    HPVpU-31B0.5 μl
    HPVpU-2R0.5 μl
    TaKaRa Taq(5 U/μl) 0.25 μl
    試料ゲノムDNA0.5 μg
    滅菌精製水up to 50 μl

    *TaKaRa Taqに添付

  2. 以下の条件でPCRを行う。

    94℃、30 sec 30 cycles
    55℃、2 min
    72℃、30 sec

  3. 反応終了後、反応液10 μlをとり、4% PrimeGel Agarose PCR-Sieveを用いてアガロースゲル電気泳動を行い、DNAの増幅を確認する(228~268 bpの増幅DNAが得られる)。
  4. 3. で増幅が確認されたサンプルについては、反応液をフェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、増幅DNAを精製する。DNAはTE Buffer 10 μl(約0.1~0.2 μg/μl)に溶解する。

(3)Enzyme Set Aを用いたHPV型の判別

本セットを用いてPCRにより増幅されたDNAフラグメントは、Enzyme Set A(製品コード 6604)を用いて制限酵素処理し、その後の電気泳動パターンによりHPV型を判別することができる。
A.悪性型HPVのタイピング
  1. (2)-3. でHPVpU-M/HPVpU-2Rのプライマー対により増幅が確認されたサンプルについては、Enzyme Set Aを用いて、悪性型HPVのタイピングを行う。まず、以下の反応液を調製し、増幅DNAに対して30℃で1時間VpaK11B I (Ava II)を作用させる。反応終了後、4% PrimeGel Agarose PCR-Sieveアガロースゲルゲル電気泳動を行い、フラグメントの切断パターンを確認する。VpaK11B I (Ava II)消化によりHPV16、18、33の型を決定することができる(表2)。
    増幅DNA1 μl(0.1~0.2 μg)
    10×VpaK11B I Buffer2 μl
    VpaK11B I (Ava II)0.5 μl(5 U)
    H2O16.5 μl
    Total20 μl

  2. VpaK11B I (Ava II)で消化されない場合は、Bgl II、Afa I、Acc I、BmeT110 I (Ava I)のいずれかを用いて37℃で1時間反応を行い、HPV型を決定する(表2-a))。各制限酵素に適したUniversal Bufferは以下の通りである。

    Bgl IIUniversal Buffer H
    Afa IUniversal Buffer T、0.01% BSA(反応液最終濃度)
    Acc IUniversal Buffer M
    BmeT110 I (Ava I)Universal Buffer K

B.良性型HPVのタイピング
(2)-3. でHPVpU-31B/HPVpU-2Rのプライマー対により増幅が確認されたサンプルについては、Enzyme Set A中のAfa Iを用いて、良性HPVのタイピングを行う。A. -1. と同様に、Afa Iを作用させ(T + 0.01% BSA Bufferを用いる)、HPV6とHPV11を判別する(表2-b))。
表2 コンセンサスプライマーによる増幅産物の制限酵素切断パターン
a)HPVpU-1M/HPVpU-2R
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HPV型HPV16HPV18HPV31HPV33HPV35HPV52bHPV58
増幅全鎖長(bp) 238 268 232 244 232 231 244
制限酵素VpaK11B I (Ava II)   
Afa I   
Bgl II   
Acc I   
BmeT110 I (Ava I)   
158/81
NC
NC
NC
NC
172/96
NC
NC
NC
NC
NC
117/115
NC
NC
NC
136/108
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
186/46
NC
NC
176/55
NC
NC
NC
NC
NC
126/118
NC
b)HPVpU-31B/HPVpU-2R
HPV型HPV16HPV11
増幅全鎖長(bp) 228 228
制限酵素Afa I   
VpaK11B I (Ava II)   
Bgl II   
Acc I   
BmeT110 I (Ava I)   
132/96
NC
NC
NC
NC
166/62
NC
NC
NC
NC

数字は制限酵素消化後の各フラグメント長を示す。
NC;切断されない

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