TaKaRa PCR Amplification Kit

[TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceを使用した場合]

本キットには、コントロールとしてλDNAおよびλDNAの6,012 bpまたは500 bpのターゲットシーケンスを増幅するためのプライマーが含まれている

1. 下記に示す反応液を調製する。

   	液量	終濃度
   10×PCR Buffer（Mg2＋ plus）*	5 μl	［1×］
   dNTP Mixture	4 μl	各200 μM
   Control Primer1	0.5 μl	0.2 μM
   Control Primer2 or 3	0.5 μl	0.2 μM
   TaKaRa Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   Control Template	0.5 μl	0.5 ng/50 μl
   滅菌精製水	39.25 μl
   Total	50 μl

   
   * 必要に応じて10×PCR Buffer（Mg^2＋ free）およびMgCl₂溶液をご使用ください。
2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceの本体にセットする。
3. 以下の条件を設定する。
   Control Primer 1、2を用いた場合（6,012 bpの増幅）
   

   94℃、1 min（denaturation）	30 cycles
   68℃、4 min（annealing and extension）
   72℃、5 min	1 cycle

   
   
   Control Primer 1、3を用いた場合（500 bpの増幅）
   

   94℃、30 sec（denaturation）	25 cycles
   55℃、30 sec（annealing)
   72℃、30 sec（extension）
   72℃、2 min	1 cycle

   
   
   以上の条件でControl Templateのターゲットシーケンスが増幅される。

基本的にはコントロール反応と同じ。
PCR反応はdenature, annealing extentionの3段階の温度変化を基本してるが、増幅鎖長が長い場合（＞＝6kb）には、annealingとextentionを兼ねた2段階の温度変化条件（シャトルPCR）の方が適している場合がある。
ただし、ターゲットシークエンスのサイズ、プライマーのサイズや塩基配列に応じたdenaturation、annealing、extension各ステップの最適条件（温度、時間）をプログラムして反応を行う必要がある。

反応終了後の溶液5～10 μlについて6×Loading Bufferを1/6量加え、アガロースゲルのスロットに注入し、電気泳動を行う。アガロースゲルの種類、濃度はDNAのサイズ、目的によって使い分ける。
電気泳動後のゲルを1μg/mlのエチジウムブロマイド水溶液もしくはSYBR Green I溶液（TBE bufferまたはTAE bufferで10,000倍希釈したもの）中に20～30分間放置、染色後紫外線照射のよってDNAのバンドを確認する。

●	キットの内容物はvortexにて約2秒よく撹拌し、遠心後使用する。ただし、TaKaRa Taqはピペッティング操作で注意深くゆっくりと撹拌する。また各内容物は使用直前まで氷上で保存する。
●	サンプルDNA中にプロテアーゼのコンタミネーションの可能性がある場合は、最初の熱変性ステップ（denaturation step）の後でTaKaRa Taqを加えること。プロテアーゼは熱失活し、TaKaRa Taqの分解を防ぐことができる。
●	サンプルDNAの調製方法によっては10×PCR Buffer（Mg2＋ plus）のMg2＋濃度が至適でない場合がある。この場合は10×PCR Buffer（Mg2＋ free）を用いてMg2＋濃度を変えて予備実験し、至適Mg2＋濃度を確認する必要がある。