| 1） |
100 mlのPD培地にA. nidulansの胞子懸濁液（0.5 ml）を植菌し、30℃で12～20時間振盪培養する（バッフル付き三角フラスコ等で激しく振盪する）。 |
| 2） |
ガラスろ過器（3G1）でろ過して菌糸を集める。滅菌水で洗浄後、スパーテル等で押さえて菌糸から水分を十分に除く。 |
| 3） |
適当量（数百μl相当）の菌糸を50 mlポリプロピレン製遠心管中の10 mlのプロトプラスト化溶液に加えて懸濁する（加える菌糸の量は、溶液中で菌糸がサラサラ動く程度）。 |
| 4） |
30℃で1～2時間ゆるやかに振盪し、プロトプラスト化する（顕微鏡で確認する）。 |
| 5） |
ガラスろ過器（3G2）でろ過し、そのろ液を2,000 rpmで5分間遠心してプロトプラストを集める。 |
| 6） |
プロトプラストを0.8 M NaClで2回洗浄する。 |
| 7） |
プロトプラストを2×108/mlとなるようにSolution 1に懸濁し、0.2容量のSolution 2を加えて緩やかに懸濁する（Solution 2は粘性が高いので、十分に懸濁する）。 |
| 8） |
0.2 mlのプロトプラスト懸濁液（10 ml以上のポリプロピレン製遠心管に入れる）にプラスミド（20 μl以下）を加える（プラスミドは最大20 μgまでにする）。 |
| 9） |
氷中で10分間静置する。 |
| 10） |
1 mlのSolution 2を加え、緩やかに懸濁する。 |
| 11） |
室温で10～15分間静置する。 |
| 12） |
10 mlのSolution 1を加え、緩やかに懸濁する。 |
| 13） |
遠心してプロトプラストを集める。上清をできるだけ除き、プロトプラストを0.2 mlのSolution 1に懸濁する。 |
| 14） |
SD選択プレートにプロトプラスト懸濁液をのせ、5 ml（90 mmφシャーレ当たり）のSD軟寒天選択培地を加え、プロトプラストが均一に分散するようにすばやく重層する。 |
| 15） |
30℃で5～7日間培養する。 |
| 注）器具および溶液はすべて滅菌し、操作は無菌的に行う。 |
