DNA Ligation Kit

プラスミドベクターへの外来DNAの挿入(Ver.2.1)

(1)プラスミドベクター〔0.03 pmol;pUC 18 DNA (2,686 bp)の場合 約50 ng〕およびインサートDNA(0.03~0.3 pmol)を含むDNA溶液〔100 mM Tris-HCl(pH7.6)、 5 mM MgCl2が望ましい*〕5~10 μlを用意する。
(2)(1)のDNA溶液と等量のI液(5~10 μl)を添加し、よく混合する。
(3)16℃**で30分間***保温する。
(4)直ちに形質転換を行う場合には、100 μlのコンピテントセルに10 μl****の反応液を加える。

* TE Buffer(10 mM Tris-HCl(pH8.0)、1 mM EDTA)でもほぼ同様の効率が得られる。
** 反応温度を上げると(>26℃)環状DNAが形成されにくくなる。
*** ライゲーションが起こりにくい場合は時間をのばしてもよいが、効率があまり変わらない場合にはDNAを精製し直した方がよい。なお、T-Vectorを用いてPCR産物のライゲーションを行う場合には、反応時間を1時間以内とする。長時間反応させるとバックグラウンドが高くなることがある。
**** Ligation kit溶液は反応後そのまま形質転換に用いることができるが、反応終了後の反応液9 μlに対して1 μlのIII液を加えてから形質転換に用いると、より多くのコロニー(形質転換体)を得ることができる。また、大量のDNA溶液をコンピテントセルに加える場合、およびエレクトロポレーションにより形質転換を行う場合は、エタノール沈殿によりDNAを回収してから行うこと。

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