PrimeScript™ Reverse Transcriptase
1st-strand cDNA合成反応（製品コード 2680A）
- マイクロチューブ内で以下の液を混合する。
| Oligo dT primer | 50 pmol |
| （or Random primer（6 mers） | 50 pmol） |
| （or Gene specific primer | 2 pmol） |
| dNTP mixture（10 mM each） | 1 μl |
| （（or 2.5 mM each） | 4 μl） |
| 鋳型RNA | total RNA：5 μg以下、mRNA：1 μg以下 |
| RNase free dH2O | up to 10μl |
- 65℃で5分間保温した後、氷上で急冷する。
- 以下の反応液を加え、全量を20 μlにする。
| 上記鋳型RNA/ Primer Mixture | 10 μl |
| 5×PrimeScript Buffer | 4 μl |
| RNase Inhibitor | 20 U |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | 100～200 U |
| RNase free dH2O | up to 20 μl |
- 軽く撹拌する。
- 以下の条件で反応する。
| 30℃ | 10 min.*1 |
| 42（～50）℃*2 | 30～60 min. |
*1 Random 6 mersを用いた場合に必要
*2 PrimeScript Reverse Transcriptaseは高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃を推奨する。RT-PCRにおいて、PCR 下流プライマーを逆転写プライマーとして使用するとミスプライミングによる非特異的な増幅産物が生じる場合があるが、そのような場合には逆転写反応温度を50℃にすることで改善が見られる。
- 70℃で15分間保温した後、氷上で冷却する。
こうして得られた反応液は、PCRの鋳型として、あるいは2nd-strand合成反応に使用できる。
PrimeScript™ Reverse Transcriptase
